工業激光共焦顯微鏡的主要原理是利用激光掃描束通過光柵針孔形成點光源，在熒光標記標本的焦平面上逐點掃描，采集點的光信號通過探測針孔到達光電倍增管(PMT)，再經過信號處理，在計算機監視屏上形成圖像。對于物鏡焦平面的焦點處發出的光在針孔處可以得到很好的會聚，可以全部通過針孔被探測器接收。而在焦平面上下位置發出的光在針孔處會產生直徑很大的光斑，對比針孔的直徑大小，則只有極少部分的光可以透過針孔被探測器接收。而且隨著距離物鏡焦平面的距離越大，樣品所產生的雜散光在針孔處的彌散斑就越大，能透過針孔的能量就越少，因而在探測器上產生的信號就越小，影響也越小。正由于共焦顯微僅對樣本焦平面成像，有效的避免了衍射光和和散射光的干擾，使得它具有比普通顯微鏡更高的分辨率，并在生物學中獲得了廣泛的應用。
工業激光共焦顯微鏡脫離了傳統光學顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經照明針孔，經由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標本焦平面上每一點進行掃描。 組織樣品中如果有可被激發的熒光物質，受到激發后發出的熒光經原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管（PMT）探測收集，并將信號輸送到計算機，處理后在計算機顯示器上顯示圖像。 在這個光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，即共聚焦。以激光作光源并對樣品進行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。
工業激光共焦顯微鏡從產生至今獲得了巨大的發展，掃描方式從zui初的狹縫掃描方式（掃描速度較快，圖像分辨率不高），到階梯式掃描技術（提高了圖像分辨率，標本制備要求太高），再到驅動式光束掃描器（掃描速度較快，符合共聚焦原理）。另外，目前激光掃描共聚焦顯微鏡的光源設計和分光采集技術也有較大的改進，主要集中在如下幾個方面：
（1） 現代的工業激光共焦顯微鏡可以根據研究需要選擇不同的激光器。選擇激光光源時，一方面要滿足研究工作對波長的需求，另一個方面要考慮到激光光源的壽命。
（2）一代激光掃描共聚焦顯微鏡可以用棱鏡狹縫分光的新技術，配上合適的激光源后，能夠擺脫傳統的波長濾片組的限制，連續和自由地選擇*波長。
（3）用于工業激光共焦顯微鏡的物鏡也做了較大的改進，不但具有平場復消色差特性，而且能與高速掃描功能相匹配。
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