HUVEC-人臍靜脈內皮細胞培養 

★CQ★實驗材料-新生兒臍帶

試劑： PBS、膠原酶、M199培養基、胰酶、EDTA、DMEM培養基。

儀器、耗材：針頭、手術鉗、離心管、低溫離心機、彎管、明膠、恒溫培養箱、顯微鏡。

★CQ★步驟：

1.將 15-20cm 長的新生兒臍帶放入無菌的 PBS 溶液中儲存。（注：4℃下多貯存 24 小時，室溫下不超過 6 小時，否則廢棄）

2. 用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗 3-5 次，將污血沖洗干凈為止。

3. 用手術鉗夾緊臍帶下端，加入 15ml 的膠原酶（1mg/ml）室溫下消化 15-20分鐘，并不時上下搖動臍帶。

4. 消化完后，將下端手術鉗松開，消化液流入一個 50 ml 無菌離心管中，用無菌的 PBS 溶液沖洗臍帶 2-3 次。

5. 將收集液離心（2000 轉/ 分）3 分鐘。

6. 倒去上清，加入 10ml M199 培養基（加入 10U/ml 的 bFGF） ，用彎管吹散細 胞，將所有液體轉入一個用明膠包被好的培養瓶中，37℃培養。（注：每個培養瓶中加入 3- 4ml 無菌的 1%的明膠溶液，搖勻使得明膠溶液* 鋪滿瓶底，放入 37℃孵育，少 2 小時，用前將明膠溶液倒了即可，明膠包被 有利于細胞貼壁。 ）

7. 培養 24 小時后，倒掉培養基，并用無菌的 PBS 溶液清洗 2-3 次，洗掉紅細 胞和死細胞，加入 10 ml 新鮮的 M199 培養基。

8. 以后每 2 天換一次培養基（每次換掉 2/3 的培養基） 。

9. 一般培養 5-7 天，細胞可長滿至 80-90%單層，這時可以傳代。

10. 倒掉培養基，用無菌的PBS 溶液清洗 2-3 次，加入2- 3ml 消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化細胞，在顯微鏡下觀察，一旦細胞變圓，即加入 2-3 倍的有血清的 DMEM 培養基終止反應。

11. 用彎管將細胞吹打下來，并將所消化的細胞轉移到一個 50 ml 無菌離心管中，2000 轉/分，離心 3 分鐘。

12. 倒掉上清，加入 10ml新鮮培基，一般一瓶細胞可傳代 3-4 瓶，以后照此傳代培養。

13. 一般傳代 2-3 代（培養了 20 天左右）用于做各種實驗效果zui佳。