冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

產(chǎn)品屬性：

名稱    NK細胞
產(chǎn)品概述

NK細胞，即自然殺傷細胞(Natural killer cell，NK)是機體重要的免疫細胞，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發(fā)生，能夠識別靶細胞、殺傷介質(zhì)。

NK細胞確切的來源還不十分清楚，一般認為直接從骨髓中衍生，其發(fā)育成熟依賴于骨髓的微環(huán)境。小鼠和人的體外實驗表明，胸腺細胞在體外IL-2等細胞因子存在條件下培養(yǎng)也可誘導出NK細胞。小鼠脾臟在體內(nèi)IL-3誘導下可促進NK細胞的分化。NK細胞主要分布于外周血中，占PBMC5～10%，淋巴結和骨髓中也有NK活性，但水平較外周血低。

由于NK細胞具有部分T細胞分化抗原，如80～90%NK細胞CD2+，20～30%NK細胞CD3+（表達CD3ζ鏈），30%NK細胞CD8+（α/α）和75～90%NK細胞CD38+，而且NK細胞具有IL-2中親和性受體，在IL-2刺激下可發(fā)生增殖反應，活化NK細胞可產(chǎn)生IFN-γ，因此一般認為NK細胞與T細胞在發(fā)育上關系更為密切。

與T細胞、B細胞相比，NK細胞表面標志的特異性是相對的。人NK細胞mIg-，部分NK細胞CD2、CD3和CD8陽性，表達IL-2受體β鏈(P75、CD122），CD11b/CD18陽性。常用檢測NK細胞的標記有CD16、CD56、CD57、CD59、CD11b、CD94和LAK-1。

一種穩(wěn)定表達在NK和LAK細胞表面的LAK-1分子，120kDa，NK細胞在IL-2條件下培養(yǎng)20天LAK-1仍為陽性，而HNK-1(CD57）和CD16部分消失。LAK的殺傷活性可被抗LAK-1 McAb所抑制。

NK細胞活化途徑：

1、通過CD3分子的ζ鏈

NK細胞不表達TCR/CD3復合物，但部分NK細胞表達CD3ζ鏈，當用CD16抗體刺激NK細胞活化時，ζ鏈發(fā)生磷酸化，引起胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高，IP3水平增加，促進細胞因子合成和ADCC作用。

2、通過CD2分子

CD2與CD58相互作用或用CD2McAb刺激可活化NK細胞，CD3ζ鏈發(fā)生磷酸化。

3、自然殺傷細胞刺激因子

自然殺傷細胞刺激因子（natural killer cell stimulatory factor，NKSF)對NK細胞有刺激作用。

IL-2、IL-12、IFN-α、TNF-α以及白細胞調(diào)節(jié)素(leukoregulin，LR)對NK細胞的活化和分化有正調(diào)節(jié)作用，體外培養(yǎng)時加入上述細胞因子可明顯提高NK的殺傷活性。前列(PG)E1、E2、D2和腎上腺皮質(zhì)激素等對NK細胞的活性有抑制作用。

NK細胞表面具有IL-2中親和性受體，IL-2誘導NK的殺傷活性約需18-24小時。此外，IL-2還可誘導NK細胞的增殖，一般在刺激后3～4天開始發(fā)生增殖，其機理為IL-2可誘導NK細胞表達IL-2Rα鏈，新表達的α鏈與原先細胞表面的β鏈和γ鏈結合形成高親和性受體，在IL-2存在下刺激NK細胞發(fā)生增殖。IL-2誘導NK細胞的活性機理尚不清楚，可能與增加細胞粘附分子的表達，提高對NK抵抗靶細胞的殺傷活性有關，還可能增加NK細胞胞漿中的顆粒以及絲酯酶mRNA的表達，活化和促進殺傷介質(zhì)的殺傷作用。

培養(yǎng)操作：
1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。
2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。
3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。
4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；
1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。
3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
細胞間粘附分子-1抗體

細胞間粘附分子1抗體

周期素A1蛋白抗體

細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白3抗體

細胞因子誘導凋亡抑制因子1
人γ干擾素誘導單核細胞因子(MIG/CXCL9)elisa檢測試劑盒免費代測

人γ干擾素受體(IFN-γR)elisa檢測試劑盒

人γ干擾素(IFN-γ)抗體elisa檢測試劑盒

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人γ分泌素激活蛋白(PION)elisa檢測試劑盒免費代測
NK細胞小鼠分泌型卷曲相關蛋白2(SFRP2)elisa檢測試劑盒

小鼠分泌型卷曲相關蛋白4(SFRP4)elisa檢測試劑盒

小鼠分泌型卷曲相關蛋白5(SFRP5)elisa檢測試劑盒

小鼠分泌型磷脂酶A2(sPLA2)elisa分析檢測試劑盒

小鼠分泌型磷脂酶A2(sPLA2)elisa檢測試劑盒
實驗報告：
產(chǎn)品僅用于科研一、分離與培養(yǎng)：
1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，后將成1mm3左右大小；
2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化；
4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二、免疫熒光鑒定：
1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min；
2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；
3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min；
4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜；
5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h；
6、用PBS沖洗3次，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。