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腫瘤細胞增殖檢測:3H同位素滲入法實例

時間:2018/3/22閱讀:1082
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一、原理
腫瘤細胞在有絲分裂原PHA、ConA 等的刺激下,產生增殖反應,DNA和RNA合成明顯增加,如在培養(yǎng)液中加入3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR),則可被轉化中的細胞攝入。測定標記淋巴細胞的放射強度可反映淋巴細胞增殖的程度。
二、儀器和材料
RPMI-1640 細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-巰基乙醇(2-ME)、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A(ConA)、Hank's液、PBS緩沖液(pH7.2-7.4)、3H-TdR、閃爍液[2,5-二苯基惡唑(PPO)0.5g、1,4-雙-(5-苯基惡唑基)-苯(POPOP)0.25g、二甲苯500mL混勻]
200目篩網,96孔培養(yǎng)板(平底),手術器械、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺、液體閃爍儀、多頭細胞取集器、49型玻璃纖維濾紙。
三、實驗步驟
1、脾細胞懸液制備
無菌取脾,置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中,用鑷子輕輕將脾撕碎,制成單細胞懸液。經200目篩網過濾,用Hank's液洗3次,每次離心10min(1000r/min)。然后將細胞懸浮于2mL的*培養(yǎng)液中,用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上),zui后用RPMI1640*培養(yǎng)液將細胞數(shù)調成5×106個/mL。
2、淋巴細胞增殖反應
將脾細胞懸液加入到96孔培養(yǎng)板中,200μL/孔,每一份脾細胞懸液分裝6個孔,3孔加ConA(5ug/mL),另3個孔不加ConA 作為對照。置5% CO2,37℃培養(yǎng)72h,培養(yǎng)結束前6h,每孔加入3H-TdR 20μL,使其終濃度為(3.7-18.5)×104Bq/mL。用多頭細胞收集器將細胞取集于玻璃纖維濾紙上。濾紙片充分干燥后置測量瓶中,加入7mL閃爍液,用液閃儀測定每分鐘脈沖數(shù)(cpm)。
3、數(shù)據(jù)處理及結果判定
一般采用方差分析,但腫瘤細胞需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算F值,F(xiàn)值< F0.05,結論:各組均數(shù)間差異無顯著性;F值≥F0.05,P≤0.05,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計;對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D換,待滿足正態(tài)或方差齊要求后,用轉換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計;若變量轉換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。
以每分鐘脈沖數(shù)(cpm)表示增殖程度,用刺激指數(shù)(SI)來表示
                           實驗孔cpm
                   SI=  ─────────
                                 對照孔cpm
受試樣品組的SI值顯著高于對照組的SI值,即可判定該項實驗結果陽性。
    阿巴卡韋相關物質C標準品    172015-79-1    20mg
    替米沙坦相關物質A標準品    152628-02-9     20mg
    阿托伐他汀相關物質D標準品    148146-51-4    20mg
    曲氟胸苷相關物質A標準品    14599-46-3     20mg
    氯吡格雷相關雜質B標準品    144750-52-7    20mg
    氯吡格雷相關雜質A標準品    144750-42-5    20mg
    R-佐米曲坦異構體標準品    139264-24-7     20mg
    三氯氨絡鉑酸鉀標準品    13820-91-2     20mg
Sennoside B     番瀉苷B標準品    128-57-4     20mg
    阿巴卡韋相關物質A標準品    124752-25-6    20mg
腫瘤細胞

 

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