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免疫組化步驟剖析(二)

閱讀:3931      發布時間:2018-2-24
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 1、血清封閉:

組織切片上有剩余的位點可以與一抗非特異性結合,造成后續結果的假陽性;因此需要使用封閉劑進行封閉。常用試劑為血清和BSA等。封閉血清一般是和二抗同一來源的,但不能與一抗來源一致。

 2、一抗和二抗濃度和孵育時間:

一抗孵育條件在免疫組化反應中zui重要,包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度效果*;孵育時間與溫度、抗體濃度有關,一般37度1-2h,4度過夜(從冰箱拿出后37度復溫45min)。具體條件還要摸索。二抗一般室溫或37度30min-1h,具體時間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度。

3、抗體稀釋液:

抗體稀釋液:其實許多實驗室抗體稀釋液就用一般PBS即可,另外還可以加NaN3防腐劑、BSA穩定劑等組份,對抗體的多次回收利用較好。
4、切片清洗(浸洗、沖洗和漂洗):

為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長時間和增多次數)尤為重要。需注意:

    (1)單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。

    (2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。

    (3)沖洗的時間要足夠,才能*洗去結合的物質。

    (4)PBS的PH和離子強度的使用和要求(建議 PH 7.4- 7.6,濃度是 0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解)。

5、DAB顯色:

背景的深淺和特異性染色的深淺均可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的,主要由顯微鏡下控制顯色時間,到出現特異性染色較強而本底著色較淺時即可沖洗。

6、復染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進行定位,經常用蘇木素復染(胞核染料)。

7、封片:為了長期保存,一般用中性樹膠封片,避免產生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時為止;當發現液體接觸面在不斷彌散時,則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會產生氣泡。

 

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