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BD單細(xì)胞測序聯(lián)合Absin多色,共同探索腦部腫瘤微環(huán)境

閱讀:1328      發(fā)布時(shí)間:2022-12-15
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腦惡性腫瘤又常稱為腦癌,分原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類:原發(fā)性腦惡性腫瘤以腦膠質(zhì)瘤最多,是一種起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的腫瘤;繼發(fā)性腫瘤主要是指其他部位的腫瘤轉(zhuǎn)移到腦內(nèi)形成的腦轉(zhuǎn)移性腫瘤,其發(fā)病率約是原發(fā)腫瘤的10倍,肺癌就是常見的原發(fā)癌種之一。

2022年11月6日,復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院金偉教授和曹依群教授團(tuán)隊(duì)在Clin. Transl. Med(IF=8.554)上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases"的文章,通過scRNA-seq技術(shù)(BD Rhapsody system)聯(lián)合多重?zé)晒饷庖呓M化(abs50015,Absin),解析了GM和LC細(xì)胞的異質(zhì)性,發(fā)現(xiàn)了一組具有特異性分子標(biāo)記的干細(xì)胞樣細(xì)胞,對于肺癌腦轉(zhuǎn)移的免疫療法有重要的指導(dǎo)性意義。




取樣、測序、分析和組織原位驗(yàn)證的全流程

研究中,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一部分增殖巨噬細(xì)胞簇與不良預(yù)后相關(guān)。氣泡圖顯示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)駐留小膠質(zhì)細(xì)胞(CNS)以及單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(MDMs)表達(dá)TAMs相關(guān)基因的情況,其中CD163在MDMs高表達(dá),而在CNS顯著低表達(dá)。通過小提琴圖分析可得,TOP2A基因在增殖巨噬細(xì)胞的分布(后兩列),中位值都比其他細(xì)胞更好。后續(xù)研究團(tuán)隊(duì)通過對TOP2A和CD163進(jìn)行多重免疫熒光染色在組織蛋白層面驗(yàn)證了細(xì)胞群。


癌癥干細(xì)胞(CSCs)是會(huì)導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移和化療或放療耐藥性的細(xì)胞亞群。研究團(tuán)隊(duì)通過拷貝數(shù)變異分析鑒定了惡性細(xì)胞并劃分為10個(gè)惡性上皮細(xì)胞亞群,基于CytoTRACE分析和擬時(shí)序分析顯示,惡性上皮細(xì)胞亞群中Mep_C3和C8分化程度較低,可能包含CSCs。為了證實(shí)Mep_C3和_C8在LC組織中的存在,團(tuán)隊(duì)通過多重免疫組化檢測了主要標(biāo)記物的表達(dá)(EPCAM/DKK1/TRIM29),發(fā)現(xiàn)DKK1和TRIM29在這些細(xì)胞中特異性富集。



總的來說,團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果為小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、ECs和T細(xì)胞的特征提供了特別的見解,還發(fā)現(xiàn)了癌癥干細(xì)胞的一個(gè)子集,這將加深對大腦腫瘤微環(huán)境的理解,從而為精準(zhǔn)醫(yī)療的患者管理提供一些改善思路。

 

多色小知識

多色即多重?zé)晒饷庖呓M化(mIHC),主要原理來自TSA技術(shù),TSA即酪酰胺信號放大(Tyramide signal amplification)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法。該技術(shù)可與高性能染料Alexa Fluor®、傳統(tǒng)熒光染料和比色檢測系統(tǒng)相兼容。

TSA主要原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H2O2下形成共價(jià)鍵結(jié)合位點(diǎn)),產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物,該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合,這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的生物素沉積,與隨后加入的Streptavidin—HRP/熒光基團(tuán)結(jié)合,經(jīng)幾次這樣的循環(huán)放大,可以結(jié)合大量的酶分子or熒光基團(tuán),結(jié)果使其檢測信號得到幾何級放大。

簡單來說,用這種方法做多重?zé)晒馊旧抢枚股蠋в械腍RP(而不是直接偶聯(lián)熒光素),來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。該熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化,跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價(jià)偶聯(lián),使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后進(jìn)行微波處理,前一輪非共價(jià)結(jié)合的抗體被洗掉,共價(jià)結(jié)合的熒光素還留存在樣品上。再換個(gè)一抗來第二輪孵育,周而復(fù)始。等到所有抗體孵育結(jié)束,熒光素都結(jié)合好后,最后去檢測結(jié)果。



TSA多重?zé)晒饷庖呓M化染色示意圖

“墻裂"安利:Absin多色一站式解決方案

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種屬

六色  FLASH panel

應(yīng)用

備注

panCK、CD3、CD19、CD68、CD56

常規(guī)腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞panel,可評估腫瘤微環(huán)境冷熱,方便探究腫瘤抑制手段效果

可更換其他免疫細(xì)胞指標(biāo)及腫瘤指標(biāo)

小鼠

panCK、CD3、CD19、F4/80、NK1.1

CD4、CD8、LAG3、TIM-3、PD-1

涵蓋多熱門免疫檢查點(diǎn)

可替換其他染過的免疫檢查點(diǎn)指標(biāo)

小鼠

CD4、CD8、LAG3、TIM-3、PD-1

種屬

五色  FLASH panel

應(yīng)用

備注

CD3、CD4、CD8、FOXP3

T細(xì)胞分型panel

FOXP3可替換為TH1指標(biāo)T-bet或者TH2指標(biāo)GATA-3

小鼠

CD3、CD4、CD8、FOXP3

panCK、CD68、CD163、HLA-DR

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞TAM及分型panel

小鼠

panCK、F4/80、CD86、CD163

panCK、CD8、PD-1、PD-L1

經(jīng)典PD-1/PDL1可行性分析panel

種屬

四色  FLASH panel

應(yīng)用

備注

a-SMA、panCK、VEGF

腫瘤相關(guān)成纖維及血管生成因子

可更換FAP、VIM、FGF等相關(guān)因子

小鼠

a-SMA、panCK、VEGF

CD8、ki-67、Granzyme B

T細(xì)胞活化及增殖panel

小鼠

CD8、ki-67、Granzyme B


參考文獻(xiàn):

Sun HF, Li LD, Lao IW, Li X, Xu BJ, Cao YQ, Jin W. Single-cell RNA sequencing reveals cellular and molecular reprograming landscape of gliomas and lung cancer brain metastases. Clin Transl Med. 2022 Nov;12(11):e1101. doi: 10.1002/ctm2.1101. PMID: 36336787; PMCID: PMC9637666.


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