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酚氧化酶（PO）檢測|茁彩生物
閱讀：241 發布時間：2025-3-4酚氧化酶（phenoloxidase，PO）是一種含銅的氧化酶，在生物的免疫防御、傷口愈合、色素形成等生理過程中發揮重要作用。
酚氧化酶能夠催化酚類物質（如鄰苯二酚、L - 多巴等）氧化成醌類物質，醌類物質進一步聚合形成有色的色素，通過測定反應體系中生成的有色物質在特定波長下的吸光度變化，來反映酚氧化酶的活性。不同的酚類底物在被酚氧化酶催化氧化后生成的產物顏色不同，且在不同波長下有最大吸收峰，例如鄰苯二酚氧化產物在 490nm 左右有吸收峰，L - 多巴氧化產物在 475nm 左右有吸收峰。
檢測步驟
樣本制備：
生物組織（如昆蟲的血淋巴、動物的組織器官等）中的酚氧化酶，需要先對樣本進行處理。以昆蟲血淋巴為例，用合適的抗凝劑（如含有PMSF的緩沖液）收集血淋巴，防止酚氧化酶在體外被激活而發生自氧化。若檢測的是組織中的酚氧化酶，則需要將組織勻漿，然后離心取上清液作為酶液，勻漿過程中可使用含有蛋白酶抑制劑的緩沖液，以保護酶的活性。
標準曲線繪制：配制一系列不同濃度的酚類底物的氧化產物標準溶液（如醌類物質的標準溶液），在其最大吸收波長下測定吸光度，以吸光度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
酶活性測定：在反應體系中加入一定量的酶液（上述制備的樣本上清液）、酚類底物溶液（如一定濃度的鄰苯二酚或 L - 多巴溶液）和緩沖液（如 pH 6.0-7.5 的磷酸緩沖液，維持反應體系的 pH 穩定），總體積根據實驗需求確定（如 1mL）。同時設置對照組，對照組中可加入經熱處理使酶失活的酶液，其他成分與實驗組相同。將反應體系置于適宜溫度（如 25℃或 37℃）的恒溫振蕩器中反應一定時間（如 10-30 分鐘），然后加入適量的終止液（如強酸或強堿溶液使酶失活）終止反應。
吸光度測定與結果計算：將反應液轉移至比色皿中，在酚類底物氧化產物的最大吸收波長下，使用分光光度計測定吸光度。根據標準曲線計算出反應體系中生成的氧化產物的量，再根據酶液的加入量、反應時間、反應體系體積等參數，計算出酚氧化酶的活性，通常以單位時間內生成一定量氧化產物所需的酶量來表示（如 U/mL）。