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《生物多樣性研究基金》申報通知

基本信息

主題：TRPV4（一種NSCC）通過硬骨魚催產素途徑調節斑馬魚離子平衡

期刊：Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol

影響因子：3.176

研究使用平臺：NMT斑馬魚創新科研平臺

標題：Transient receptor potential vanilloid 4 modulates ion balance through the isotocin pathway in zebrafish (Danio rerio)

作者：中國臺灣師范大學林豊益、劉咸臺

檢測離子/分子指標

H⁺

檢測樣品

斑馬魚卵黃囊的H⁺-ATPase富集細胞（HR細胞）

中文摘要（谷歌機翻）

—硬骨魚催產素通過調節離子細胞（也稱為富線粒體細胞或氯化物細胞）的功能來控制離子調節。但是，關于硬骨魚催產素蛋白系統的上游分子知之甚少。在本文中，我們確定了瞬態受體電位香草酸4（TRPV4），其調節硬骨魚催產素的mRNA和蛋白質表達并通過硬骨魚催產素途徑影響離子調控。雙重免疫組織化學結果顯示，TRPV4在成年斑馬魚腦下丘腦的同種異能神經元中表達。為了進一步闡明TRPV4的作用，我們操縱了TRPV4蛋白的表達并評估了其在斑馬魚胚胎中的離子調節功能。用嗎啉代寡核苷酸敲低TRPV4基因可降低整個幼蟲的離子含量（Na⁺，Cl^-和Ca²⁺）和斑馬魚幼體皮膚的H⁺分泌功能。在TRPV4突變體中，也抑制了離子細胞相關轉運蛋白的mRNA表達，包括H+-ATPase，上皮Ca²⁺通道和Na-Cl協同轉運蛋白。TRPV4敲除后，斑馬魚幼蟲皮膚中的離子細胞（富含H+-ATPase的細胞和富含Na-K-ATPase的細胞）和表皮干細胞的數量也減少了。我們的結果表明，TRPV4通過硬骨魚催產素途徑調節離子平衡。

離子/分子流實驗處理方法

對受精后三天的斑馬魚進行TRPV4敲除。

離子/分子流實驗結果

通過NMT分析了斑馬魚幼體卵黃囊的酸分泌。在卵黃囊表面記錄到了代表酸分泌的H⁺外排。在TRPV4突變體中酸分泌分別下降了21.9％和67.6％，這表明卵黃囊（左圖）和HR的細胞（右圖）的酸分泌受到抑制。

其他實驗結果

• TRPV4是由斑馬魚大腦中的isotocinergic神經元表達的

• Western blot分析表明，在對照組中，抗TRPV4抗體識別出一條98kda的TRPV4蛋白帶。在0.5ng TRPV4-嗎啉修飾反義寡核苷酸1（MO1）突變體中，該條帶較微弱。表明TRPV4蛋白表達受trpv4 MO1的抑制

• 在TRPV4突變體中，同位素的mRNA和蛋白質表達均顯著降低

• 注射TRPV4MO 可顯著降低斑馬魚胚胎的離子含量

• 用RT-qPCR法檢測了trpv4突變體中H⁺-ATPase（HA）、上皮Ca²⁺通道（ECaC）和Na⁺-Cl^-共轉運體（NCC）的mRNA表達，發現HA、ECaC和NCC基因表達分別下降了39%、42%和62%。

• TRVP4突變體中HR、Na⁺-K⁺-TAPase-rich（NaR）細胞和P63細胞密度均降低，表明TRPV4基因敲除了降低了表皮干細胞的數量。

結論

在本研究中，我們*證明，TRPV4由斑馬魚下丘腦中的同位素神經元表達。TRPV4表達功能的喪失降低了同位素mRNA和蛋白表達，并減少了表皮干細胞和離子細胞的數量。我們還觀察到在TRPV4突變體中離子細胞的功能被下調。我們的研究結果表明TRPV4充當調節硬骨魚催產素功能的上游分子。

離子流實驗使用的測試液

Normal water, 300μMMOPS buffer, 0.1 mg/L ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，pH7.0