您好, 歡迎來到化工儀器網
北京林大陳少良：REM6.5 激活質膜質子泵促植物耐鹽
| NMT作為生命科學底層核心技術，是建立活體創新科研平臺的*技術。2005年~2020年，NMT已扎根中國15年。2020年，中國NMT銷往瑞士蘇黎世大學，正式打開歐洲市場。 |
基本信息
主題：REM6.5 激活質膜質子泵促植物耐鹽
期刊：Tree Physiology
影響因子：3.477
研究使用平臺：NMT植物耐鹽創新平臺
標題：Populus euphratica remorin 6.5 activates plasma membrane H+-ATPases to mediate salt tolerance
作者：北京林業大學陳少良、張會龍
檢測離子/分子指標
Na+，H+，K+
檢測樣品
7日齡擬南芥（WT和轉基因）根分生區（距根尖200µm根表上的點）
中文摘要（谷歌機翻）
Remorins（REM）在植物適應不利環境的能力中起著重要作用。PeREM6.5是胡楊，耐鹽楊樹中REM家族的一種蛋白質，是由愈傷組織，根和葉中的NaCl脅迫誘導的。我們從胡楊假單胞菌中克隆了全長PeREM6.5，并將其轉化為大腸桿菌和擬南芥。PeREM6.5重組蛋白顯著提高了胡楊質膜（PM）囊泡中的H ATPase水解活性和H+轉運活性。酵母雜交分析表明，胡楊REM6.5與RPM1相互作用蛋白4（PeRIN4）相互作用。PeRI N4重組蛋白增強了PeREM6.5誘導的PM H+ -ATPase活性的增加，在擬南芥中PeREM6.5的正向表達在存活率，根生長，電解質滲漏和丙二醛含量方面顯著提高了轉基因植物的耐鹽性。過表達PeREM6.5的擬南芥植物在體內和體外試驗中均保持較高的PM H+ -ATPase活性。由于H+ -ATPases促進了Na的擠出，PeREM6.5轉基因植物的Na積累減少，而且H+泵引起了血漿膜的每極化，降低了鹽堿化根系PM中去極化激活通道介導的K+損失，因此，我們得出以下結論：帽子PeREM6.5調節了PM中的H+ -ATPase活性，從而增強了植物在鹽度下保持離子穩態的能力。
離子/分子流實驗處理方法
（1）125 mM NaCl處理12小時
（2）500 μM釩酸鈉處理20分鐘
離子/分子流實驗結果
使用NMT技術，在低Na+測試液中記錄了來自對照和鹽處理植物根部的Na+外排。NaCl處理（12 h）導致所有測試株系的Na+外排顯著增加（圖1A）。轉基因植物在NaCl處理后表現出比WT植物更高的Na+外排（圖1A）。在所有測試株系中，NaCl均增加了K+的外排，但WT中的K+損失高于轉基因植物（圖1B）。
圖1
在NaCl處理下，H+由內流轉為外排，轉基因植物中的H+外排顯著高于野生型植物（圖2A）。但是，鹽誘導的H+外排被質膜（PM）H+-ATPase的特異性抑制劑釩酸鈉消除（圖2A）。該結果表明鹽誘導的H+外排是由H+泵活性增加引起的。H+外排在轉基因植物中更為明顯的事實表明，轉基因植物在NaCl脅迫下仍具有較高的H+泵活性。
PeREM6.5-轉基因植物的根在鹽脅迫下表現出比野生型植物的根更高的PM超極化（-63±2 mV），盡管在無對照植物中膜電位相似（-82±3 mV；圖2B）。膜電位越負，說明PM中的H+泵活性越高。
對PeREM6.5-轉基因擬南芥中分離的PM囊泡進行了PM H+-ATPase活性的體外測定。與野生型相比，轉基因植物通常表現出更高的ATP水解活性（2.1倍；圖2C）。因此，PeREM6.5上調了轉基因株系中PM H+-ATPase的活性。這一發現與轉基因擬南芥根系中H+轉運活性增加的體內協調一致（圖2A）。綜上所述，PeREM6.5可以提高轉基因擬南芥中PM H+-ATPase的活性。
圖2
其他實驗結果
無論NaCl濃度如何，胡楊PeREM6.5在愈傷組織、根和地上部分均對NaCl脅迫有響應。
從胡楊葉中克隆了PeREM6.5的cDNA全長1130bp。PeREM6.5氨基酸序列與populus trichocarpa（PtREM）的相似性高。結構分析預測PeREM6.5蛋白質是典型的Remorin-C結構域。
共聚焦激光掃描顯微鏡結果表明，PeREM定位于PM和細胞質。此外，PeREM6.5與PM標記FM4-64部分共定位，表明PeREM6.5是與PM相關的蛋白質。
PeREM6.5與PeRIN4相互作用，提高胡楊PM H+-ATPase的酶活性。
半定量逆轉錄PCR和RT-qPCR顯示，OE2、OE15和OE21表達的PeREM6.5轉錄水平高于其他株系。
PeREM6.5過表達提高了擬南芥的耐鹽性。
鹽處理（12h）顯著增加了所有試驗株系的根細胞內Na+濃度。然而，轉基因株系中的Na+特異性熒光低于野生型。與鹽漬化根相比，在對照條件下熒光強度幾乎無法檢測。
結論
基于我們的研究結果，我們得出結論：PeREM6.5介導了胡楊的H+泵活性。鹽處理誘導了胡楊中REM6.5的表達，編碼蛋白與PeRIN4相互作用，穩定了H+-ATPase復合物，從而提高了PM H+-ATPase的活性。因此，PeREM6.5-PeRIN4-蛋白復合物激活的H+-泵通過Ca2+-SOS途徑促進Na+/H+反轉運。此外，活化的PM H+-ATPase保留較少的去極化PM，限制K+通過DA-KORC和DA-NSCC外排。結果表明，鹽堿環境下胡楊屬植物保持了K+/Na+的動態平衡。
離子流實驗使用的測試液
0.5 mM KCl, 0.1 mM CaCl2, 0.1 mM MgCl2, 0.1 mM NaCl, 2.5% sucrose, pH 5.8