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基本信息

主題：NMT發現NO促Pb吸收并誘導Ca²⁺流紊亂 為NO增強Pb毒性的機制研究提供證據

期刊：Plants

影響因子：2.632（2019年）

研究使用平臺：NMT重金屬創新平臺

標題：Nitric Oxide Enhances Cytotoxicity of Lead by Modulating the Generation of Reactive Oxygen Species and Is Involved in the Regulation of Pb²⁺ and Ca²⁺ Fluxes in Tobacco BY-2 Cells

作者：北京林業大學荊艷萍、武佳葉、張越

檢測離子/分子指標

Pb²⁺、Ca²⁺

檢測樣品

4日齡BY-2細胞

鉛是已知對動植物都有毒害作用的重金屬。據報道，一氧化氮（NO）參與植物對不同重金屬脅迫的響應。本研究分析了外源和內源NO在鉛誘導煙草BY-2細胞毒性中的作用，使用非損傷微測技術（NMT）重點研究了NO在活性氧（ROS）生成以及Pb²⁺和Ca²⁺流速中的作用。Pb處理誘導BY-2細胞死亡并迅速產生NO和ROS，而NO爆發發生早于ROS積累。2-4-carboxyphenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide（cPTIO）消除NO導致ROS減少，硝普鈉（SNP）補充NO導致ROS積累增加。此外，外源NO的加入刺激了Pb²⁺的內流，從而促進了細胞對Pb的吸收，加重了Pb對細胞的毒性，而去除內源性NO則產生了相反的作用。此外，研究還發現，外源性和內源性NO均增強Pb誘導的Ca²⁺外排和鈣穩態紊亂。這些結果表明，外源和內源性NO通過促進Pb²⁺的內流和積累，干擾鈣穩態，在Pb脅迫誘導的BY-2細胞死亡中發揮重要的調節作用。

離子/分子流實驗處理

1、250 μM Pb(NO₃)₂處理BY-2細胞10 h

2、250 μM Pb(NO₃)₂+0.5 μM SNP處理BY-2細胞10 h

3、250 μM Pb(NO₃)₂+100 μM cPTIO處理BY-2細胞10 h

4、0.5 μM SNP、100 μM cPTIO實時處理

本研究用250 μM Pb (NO₃)₂處理4日齡煙草BY-2細胞，立即用NMT測定Pb²⁺流速。250 μM Pb (NO₃)₂處理后，Pb²⁺內流速率恒定，平均值為70.40±2.70 pmol cm^-2·s^-1（圖1A）。添加0.5 μM SNP后，Pb²⁺內流顯著增加，達到160.56±32.83 pmol cm^-2·s^-1，顯著增加128.06%。與單獨Pb處理相比，100 μM cPTIO處理顯著抑制了Pb²⁺的內流，甚至出現6.75±0.85 pmol cm^-2·s^-1的Pb²⁺凈外排（圖1A, B）。這些結果表明，在短時間內，SNP或cPTIO的存在顯著改變了Pb (NO₃)₂處理下的的Pb²⁺流速。

圖1. Pb脅迫下施用SNP和cPTIO前后NO對煙草BY-2細胞Pb²⁺流速的影響。正值代表Pb²⁺外排，負值代表Pb²⁺內流。

圖2. 不同處理10 h后NO對煙草BY-2細胞中Pb²⁺流速的影響。正值代表Pb²⁺外排，負值代表Pb²⁺內流。

圖3. 不同處理10 h后NO對煙草BY-2細胞中Ca²⁺流速的影響。正值代表Ca²⁺外排，負值代表Ca²⁺內流。

如圖4所示，Pb脅迫誘導了Pb²⁺的內流以及ROS和NO的產生。Pb脅迫誘導的外源和內源NO作用于ROS上游，促進煙草BY-2細胞內ROS的積累和隨后的細胞死亡。外源NO和內源NO均能增強煙草BY-2細胞對Pb的毒性，其機制可能與NO能刺激Pb²⁺內流，從而促進Pb的吸收，加重Pb誘導的BY-2細胞Ca²⁺穩態失調有關。這些發現會使大家對植物細胞中NO潛在的Pb細胞毒性機制有了更好的認識。

測試液

Pb²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.25 mM Pb(NO₃)₂, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

Ca²⁺：0.1 mM KCl, 0.05 mM CaCl₂, 0.05 mM MgCl₂, 0.5 mM NaCl, 0.3 mM MES, 3% sucrose, pH 5.8

儀器采購信息

據中關村NMT產業聯盟了解，北京地區的北京林業大學于2009年采購了美國揚格公司的非損傷微測系統