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初級(jí)會(huì)員 | 第6年

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IP檢測(cè)過(guò)程中的重、輕鏈干擾解決方案

時(shí)間:2020/1/15閱讀:633
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免疫沉淀 (Immunoprecipitation,IP) 是利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后,再與ProteinA/G偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育,通過(guò)離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白復(fù)合物,沉淀經(jīng)過(guò)洗滌后,重懸于電泳上樣緩沖液,煮沸5-10min,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,離心收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。
在免疫沉淀實(shí)驗(yàn)后的WB驗(yàn)證環(huán)節(jié)中,當(dāng)使用常規(guī)的 Anti-IgG (H+L) 酶標(biāo)二抗時(shí),通常會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)免疫沉淀一抗變性后產(chǎn)生的重鏈(50kDa)和輕鏈(25kDa)兩條帶。如果檢測(cè)的目的蛋白分子量在此附近時(shí),就會(huì)受到這兩條帶的干擾。
 

 

如何避免IP檢測(cè)過(guò)程中的重、輕鏈干擾,兩種方案可供參考:
方案一:選擇WB一抗時(shí),選擇和IP用一抗不同的種屬,避免IP一抗的干擾
山羊抗兔IgG二抗,HRP標(biāo)記,AMJ-AB2003

方案二:選擇只和重鏈或輕鏈反應(yīng)的二抗

IP™ 山羊抗小鼠IgG輕鏈二抗,HRP標(biāo)記,AMJ-AB2016
IP™ 山羊抗兔IgG重鏈二抗,HRP標(biāo)記,AMJ-AB2019
如果目標(biāo)蛋白分子量小于30KD,為了避免抗體輕鏈的干擾,選擇重鏈特異性二抗;如果目標(biāo)蛋白分子量大于30KD,為了避免抗體重鏈的干擾,選擇輕鏈特異性二抗。

IP實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題匯總:

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