經(jīng)常有小伙伴對(duì)于免疫熒光（IF）的諸多問(wèn)題不知所措，下面是一些免疫熒光（IF）的常見(jiàn)問(wèn)題及優(yōu)化方案詳細(xì)解答，給受困于免疫熒光（IF）的同胞們謀個(gè)福利~

常見(jiàn)問(wèn)題一：信號(hào)弱或無(wú)信號(hào)，染色細(xì)胞過(guò)少

可能原因：

1.目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)

2.表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞過(guò)少

3.細(xì)胞通透性差

4.染色前的固定步驟破壞了抗原表位

5.通透使抗原丟失

6.抗體不識(shí)別

7.一抗稀釋度過(guò)大

8.二抗選擇錯(cuò)誤

優(yōu)化方案（與以上原因相對(duì)應(yīng)）：

1.制備細(xì)胞裂解液，用Western Blotting驗(yàn)證目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中是否表達(dá)

2.標(biāo)本中使用更多的細(xì)胞，試用其他瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法，或者使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系

3.增加通透劑作用的時(shí)間或者濃度，或改用其它的通透劑

4.改用其他固定方法

5.減少通透劑作用的時(shí)間或強(qiáng)度

6.換用其他抗體

7.同一樣品按佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定佳的一抗稀釋比例

8.使用正確的二抗

常見(jiàn)問(wèn)題二：背景過(guò)高

可能原因：

1.一抗質(zhì)量不高

2.一抗?jié)舛忍?/span>

3.二抗?jié)舛忍?/span>

4.封閉不*

5.封閉液BSA中含IgG

6.洗滌不充分

優(yōu)化方案（與以上原因相對(duì)應(yīng)）：

1.使用特異性高，效價(jià)高的一抗

2.同一樣品按佳的二抗用量作一抗稀釋曲線，以確定佳的一抗稀釋比例

3.同一樣品按佳的一抗用量作二抗稀釋曲線，以確定佳的二抗稀釋比例

4.使用二抗來(lái)源動(dòng)物的非免疫血清進(jìn)行封閉；改善封閉條件

5.使用高純度（IgG free）的BSA

6.充分洗滌

常見(jiàn)問(wèn)題三：細(xì)胞呈扁平狀

可能原因：

1.細(xì)胞片被風(fēng)干

2.使用了甲醇固定

優(yōu)化方案（與以上原因相對(duì)應(yīng)）：

1.在任何時(shí)候都不要讓細(xì)胞片干燥；使用濕盒

2.甲醇可破壞細(xì)胞膜，因此不能很好保持細(xì)胞形態(tài)。改用甲醛或戊二醛等其他固定劑

常見(jiàn)問(wèn)題四：細(xì)胞有自發(fā)熒光

可能原因：

1.使用了戊二醛固定

2.材料本身（如石蠟）有自發(fā)熒光

優(yōu)化方案：

在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用NaIO4，NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光

常見(jiàn)問(wèn)題五：細(xì)胞模糊，封片劑明亮

可能原因：

1.因洗滌不充分導(dǎo)致背景太亮

2.二抗結(jié)合太弱

優(yōu)化方案（與以上原因相對(duì)應(yīng)）：

1.充分洗滌

2.確保抗體牢固結(jié)合，確保固定良好

常見(jiàn)問(wèn)題六：整個(gè)細(xì)胞片都出現(xiàn)熒光亮點(diǎn)

可能原因：

1.二抗?jié)舛冗^(guò)高

2.二抗發(fā)生沉淀

優(yōu)化方案（與以上原因相對(duì)應(yīng)）：

1.降低二抗?jié)舛?/span>

2.過(guò)濾或離心熒光標(biāo)記二抗

以上一共提供了6個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題及相應(yīng)優(yōu)化方案，相對(duì)來(lái)說(shuō)比較簡(jiǎn)單，更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果還是要同志們?cè)俅螌?shí)驗(yàn)嘗試的，其中實(shí)驗(yàn)試劑的品質(zhì)也是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。比如說(shuō)，正常驢血清就是一個(gè)非常典型的實(shí)驗(yàn)試劑，很多熱門研究領(lǐng)域都在使用，大家也可以根據(jù)相應(yīng)問(wèn)題找到適合自己的實(shí)驗(yàn)試劑。

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