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技術(shù)文章

SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及蛋白質(zhì)的純度鑒定

閱讀:904          發(fā)布時(shí)間:2018-8-28

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理

蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí),它的遷移取決于它所帶電荷以及分子大小和形狀等因素。1967年Shapiro等人發(fā)現(xiàn),如果在聚丙烯酰胺系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS),大多數(shù)蛋白質(zhì)能與SDS按一定比例結(jié)合,即每克蛋白質(zhì)結(jié)合1.4g的SDS-復(fù)合物都帶上相同密度的負(fù)電荷,它的量大大超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因而消除了蛋白質(zhì)原有的電荷差別,使蛋白質(zhì)分子電泳的遷移率主要取決于本身的分子量,而與蛋白質(zhì)所帶的電荷無(wú)關(guān),在一定條件下,蛋白質(zhì)的分子量的對(duì)數(shù)與電泳遷移率間呈負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)的目的是對(duì)多酚氧化酶的純化度鑒定及分子量的測(cè)定,通過(guò)實(shí)驗(yàn),學(xué)習(xí)和掌握SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法蛋白質(zhì)純度和分子量的鑒定。

二、儀器與試劑

1、材料:

硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品,Sephadex G-100柱層析的樣品。

2、試劑:

(1)丙稀酰胺(Acr母液):30%Acr (Acr/Bis)

(2)10%的SDS溶液

(3)10%的過(guò)硫酸銨溶液

(4)四甲基乙二胺(TEMED)

(5)分離膠緩沖液:1.5M Tris,PH8.8

(6)濃縮膠緩沖液:1.0M Tris,PH6.8

(7)電極緩沖液:10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS,加水溶解定容至1000ml,pH8.3

(8)樣品緩沖液:0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油,巰基乙醇及溴酚蘭

(9)染色液:0.15%考馬斯亮藍(lán)R250,溶于脫色液

(10)脫色液:50%的甲醇,7%的冰醋酸的水溶液

(11)標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。

3、儀器設(shè)備:

電泳儀、垂直電泳槽等。

三、操作步驟

1、凝膠制備:

用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽(不能漏膠),垂直放置。將配制好的分離膠溶液倒入,滴加入無(wú)離子水,待凝膠聚集后,倒出無(wú)離子水,用吸水紙吸干,倒入濃縮膠,再插入梳子。

2、上樣:

分別取樣品若干ml于離心管中,按1/1~1/5比例加入5×樣品緩沖液,再沸水浴中加熱3~5min,取出待用。用微量注射器分別吸取不超過(guò) 30μl不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和試驗(yàn)樣品注入樣品槽。點(diǎn)樣結(jié)束后,調(diào)節(jié)電泳儀電流到10mA(2~3mA/em),保持電流穩(wěn)定不變,當(dāng)溴酚藍(lán)遷移到離分離膠底1~2cm時(shí),即可停止電泳。

3、染色:

電泳完畢后,取出凝膠板,浸入染色液中,在37℃溫箱中保溫過(guò)夜。倒掉染色液,24h后,即可看到清晰的蛋白質(zhì)條帶。

四、結(jié)果 (略)

五、注意事項(xiàng)

1、SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合按質(zhì)量成比例(即:1.4gSDS/g蛋白質(zhì)),如果比例不當(dāng),就不能得到準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

2、用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量時(shí),必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。不能利用這次的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為下次用。

3、有些蛋白質(zhì)由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上肽鏈(α-胰凝乳蛋白酶)組成的,它們?cè)趲€基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此,對(duì)于這一類蛋白質(zhì),SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對(duì)分子量。

4、有的蛋白質(zhì)(如:電荷異?;蚪Y(jié)構(gòu)異常的蛋白質(zhì);帶有較大輔基的蛋白質(zhì))不能采用該法測(cè)相對(duì)分子量。

5、如果該電泳中出現(xiàn)拖尾、染色帶的背景不清晰等現(xiàn)象,可能是SDS不純引起。

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