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純干貨：IHC，WB 常見問題與結果解析
閱讀：2630 發布時間：2018-9-6免疫組化結果常見問題分析
(一) 結果陰性的原因
1. 抗體濃度和質量問題以及抗體來源選擇錯誤；
2. 抗原修復不全，換修復液或加強修復；
3. 組織切片本身這種抗原含量低，設陽性對照片；
4. 血清封閉時間過長；DAB 孵育時間過短；
6. 細胞通透不全，抗體未能充分進入胞內參與反應。
(二)非特異性染色的原因（著色一片黃/背景深）
1. 抗體孵育時間過長，抗體濃度；
2. 多抗易出現非特異性，可選擇單抗；
3. 內源性過氧化物酶和生物素滅活不夠；
4. 非特異性組分與抗體結合，延長血清封閉時間；
5. DAB 孵育時間過長或濃度過高；
6. PBS 沖洗不充分，殘留抗體結果增強著色；
7. 標本染色過程中經常出現干片；
8. 脫蠟不充分；
9. 二抗與標本的內源性組織蛋白有交叉反應。
（三）染色弱陽性
1. 固定方式不當或固定時溫度過高，影響到抗原的數量和質量；
2. 不適當的抗原修復方式，抗原決定簇暴露不足；
3. 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間不足；
4. 孵育抗體前切片上了過多的沖洗液；
5. 孵育時切片未放置水平，導致抗體孵育不均勻。
（四）信號定位與預測不符的原因
1. 組織固定不及時，抗原擴散移位；
2. 抗體選擇錯誤；
3. 膜蛋白核質染色：抗原修復過長，導致細胞膜破壞，膜蛋白轉移。
WB 結果常見問題分析
1. 無條帶：抗體用錯，轉膜出錯，抗原無表達，試劑失效等；
2. 細微弱帶：上樣量少，抗體濃度低，ECL 發光液失效等；
3. 高背景：封閉不夠，一抗濃度高，洗膜不充分；
4. 非特異性條帶：抗體特異性差，也可能樣品量大，抗體濃度高；
5. 條帶出現邊緣規則的白圈：轉膜時膜和膠之間有氣泡；
6. 條帶中間出現白色：高濃度 HRP 把底物消耗過快后不發光；
7. 膜上很多黑點：膜上雜質與抗體非特異結合，洗膜充分，封閉液混勻；
8. 條帶拖尾：蛋白裂解不好，蛋白量大，抗體孵育時間長，濃度高等；
9. 出現非均一性背景：洗抗體和發光時膜出現風干情況；
10. 條帶彎曲不平整：膠配置不均勻，膠中有氣泡雜質，玻璃板沒洗干凈，電流不均一等；
11. 條帶蛋白分子量偏高/偏低：分離膠濃度選擇不恰當，蛋白質降解；
12. 所有條帶練成片：上樣量大或電泳中途停止過長，樣品彌散。
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