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免疫細胞化學與圖像分析
閱讀：946 發布時間：2018-9-12在細胞生物學中，一個常見的問題是如何獲取與細胞功能相關的各種定量測量信息。在免疫細胞化學中也存在同樣的問題。制作免疫細胞化學標本環節 較多，只要有一個環節 失誤就會影響實驗結果，除了需要精制的藥品外，還需要熟練的技術。那么，做成了理想的標本后，如何進行觀察，才能獲得盡量多的的各種定量信息，而且使這些信息能較客觀的反映出來，這就是本章 的編寫目的。
一、定量分析的重要性
目前有許多研究免疫細胞化學的文章 ，是做定性和定位研究的。如有文獻中提到，P物質在腦組織中存在于30處以上，這只是解決了定性定位問題，這些部位含P物質的量是否相同？可否用快速簡便的方法對細胞內免疫反應產物的量進行分析？從而可進行比較。所謂反應產物的“量”包括顏色深淺，其所占的長度或面積等，就要借助于圖像分析儀（image analyzer）了。
以往我們對免疫細胞化學或一般組織化學光鏡標本的觀察，對反應產物的量常用“+”號表示，一般可分為0～+++，共五個等級，這種方法對差別較大的標本當然還是可以用的，但存在以下三方面的問題：①同一張標本，不同的觀察者可以得到出不同的結論，因為這種分級沒有明確的客觀標準；②即使同一張標本同一個觀察者，間隔若干天后進行再次觀察時，可能結論也不一樣的；③后一點也是重要的一點，人的視覺是有一定限制的，用一般觀察法實際上已經丟失掉了許多可貴的信息，因為你察覺不到實際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個客觀的比較精密的標準。除了常用的儀器如顯微分光光度計(microspectrophotometer)和顯微密度計（microdensitometer）等以外，還可用圖像分析儀進行測量。前二者已有許多有關著作中介紹過，就其與靈敏來說都是夠的，但卻不能同時測出標本中某些成分的面積、體積或長度等其他極有用的參數。圖像分析儀的分析廣度則要大得多，并能明顯地提高工作效率，所得到的各種數據可通過分析儀上的計算機進行統計學處理，只要將各種統計學公式輸入計算機，選擇其中你所采用的公式，即可快速得出分析結果，告訴你有無顯著性差異。
二、圖像分析儀簡介
圖像分析儀又稱圖像分析系統（image analysis system），主要用來解決如何客觀地較地用數字來表達存在于標本中的各種信息，可稱為數學形態學。它已經成為一種*的科學研究工具，并且逐漸展現出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內容，是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段，因此，正確地測量和處理圖像已成為測量技術中的重要課題，并廣泛應用于航空遙感測量、金屬圖像測量、微電子技術中微圖形檢測、精密機件尺寸檢測，光波干涉圖、醫學生物學的研究及應用等有關領域中。圖像測量將會隨著信息科學和人工智能的發展而日益顯示其重要作用。現代圖像測量是光學、電子學、計算機技術等相互滲透的跨學科的結果，涉及廣泛的學科領域，醫學只是其中一個分支。
我們在光學顯微鏡下看到的是光學圖像，而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像，因此在顯微圖像分析中，整個系統重要關鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能地反映出光學圖像，這個過程由攝像機（圖像掃描器）、顯像管和圖像處理機（計算機）來完成（圖9-1）。圖像可通過光學顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機而產生電信號，照片或膠卷上的圖像也可以通過攝像機反映到電視屏幕上進行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素（pixel）構成的，單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰，即分辨率愈高。各廠家生產各種不同規格的產品，如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當圖像顯示時，每個像素含有兩方面的信息，即此像素的灰度及其在標本中的位置，兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。
圖9-1 圖像分析系統簡圖
有關圖像分析的學術活動，1963年召開了屆討論會，此后每四年有一次學術交流活動。1983年在美國召開了第六屆學術會議，與會代表約150人。1987年9月在法國召開了第七屆學術會議，在200多正式代表中有2/3是生物醫學方面的專家，而我國生物醫學界沒有人被邀參加，可見我國過去對如何將圖像分析應用于醫學生物學方面的研究重視得不夠，對上這方面的信息掌握得不及時。國內自70年代末期相繼從國外引進大型自動圖像分析儀后，80年代才開始將醫學生物學研究與圖像分析方法結合起來。從1981～1983年召開了三次全國體視學與圖像圖像分析學術會議，1987年召開了第四次學術會議，雖然在宣讀的論文中醫學研究已占了很大的比例，但具體應用到免疫細胞化學則實例極少，僅是一個開端。1988年中國體視學會正式成立，是在民政部登記的屬于新學科的個學會。并于1991年11月在重慶第三軍大學召開了“全國計量學在形態學研究中應用研討會”，與會代表來自22個省市，形態計量學的方法已應用到組織學、解剖學、病理學、細胞學等領域。更為可喜的是過去此類研討會都是請外商到會介紹他們的產品，為他們提供中國市場，而此次會議上本國的三家研制生產圖像分析儀的單位在大會上介紹各自的產品，以較好的性能價格比與國外產品競爭，擴大國內市場，我國在此領域的研究進展也是很快的。
三、常用的測量方法
（一）灰度
灰度（grey level）指圖像各種分顏色的深淺程度。比較的圖像分析儀可將灰度分成為256級，也有的只能將灰度分成64級，總之都是2n,24是26256是28。免疫細胞化學標本上反應產物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標本上不同染色深度區分為幾十或更多的等級，這是人眼所不及的。因此，某些實驗的結果，如果用光學顯微鏡作一般的觀察，似乎實驗組與對照組無明顯差異，而用圖像灰度法經統計學分析，則可反映出顯著性差異，說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的，在某些情況下可能會辜負了制片過程中所花費的大量精力，而得不到應有的結果。
由于免疫反應產物在細胞內不一定是均勻分布的，在同一個細胞中就可產生各種灰度，這種情況如何進行比較？有兩類方法可供選用：一種是測每個細胞的平均灰度，近年較新型的圖像分析系統有此性能，而比較早期的或比較簡單的圖像分析系統就沒有這種性能，例如某一細胞在電視屏幕上占有120個像素，按灰度級進行測量后，也許120個像素中有十多種不同的灰度，分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應產物不均勻的細胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示，例如你要觀察1000個細胞，在這些細胞中各種灰度所占的百分率可測出，并作出曲線，或用其他統計學方法處理，來進行比較。
如果用彩色圖像分析儀，除了上述的灰度測量以外，還可以將不同的灰度編成不同的顏色，使圖像更鮮明美麗，而且便于測量。彩色有兩種情況：在屏幕上出現與標本一樣的顏色稱為真色（real color），如果將不同的灰度轉換成不同的顏色則稱為假色（pseudo color），應用假色的目的是增強對比度，來改善對細胞結構的視覺識別，同時可增強輪廓用來強調結構的細節 。例如，免疫細胞化學中常用的非標記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法，終反應產物呈棕色，假設在腦內某核團的許多細胞中，呈現出不同深度的棕色，深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區別，若差別小的則不易區別了，操作者可將灰度11～15用紅色顯示，灰度16～20用藍色顯示、灰度21～25用黃色顯示、灰度26～30用綠色顯示等。一般可呈現數十種顏色。也可以將灰度11～20用深紅色顯示、灰度21～30用淡紅色顯示、灰度31～40用藍色顯示等，由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來，旁邊顯示出一條彩色帶，表明什么顏色代表什么范圍的灰度，如此可將一種顏色的免疫細胞化學標本轉換成多種彩色的，對比鮮明的照片。
有些圖像分析儀中帶有光密度計組件，光密度計能將掃描器視頻信號變換成對數等值，然后數值化，就能用光密度單位來校正。因此，光密度計把被測物的積分光密度作為主要輸出，所謂積分光密度即各個單獨探測的像素密度分布的總和。因為容易得到被測物的面積，也就很容易求出平均密度。光密度在細胞化學反應的定量領域內極為有用。灰度是一種相對值，因為你可將標本上的灰度隨你編輯分為64級、也可將其分為128級或者256組，而光密度是值。在文獻中光密度常用OD表示（optical density）。有的單位購置了圖像分析儀后才發現不能作光密度測量，但已無法再去掉換，所以在購買前必須詳細了解其性能，包括屏幕像素數、有無光密度計組件等。
（二）長度
形狀不規則的線形組織結構，一般方法很難計算出其長度，如組織中的毛細血管，神經纖維、細胞超微結構中的各種膜性結構等，以往常用排列稀疏或密度集等詞描述，圖像分析儀則可測出各種圖像周界線的長度。例如：在活檢組織的子宮頸上皮細胞的電子顯微鏡照片上，測出在一定范圍的細胞膜長度為8128像素，橋粒長度為1229像素，計算出橋粒長度占細胞膜總長度的15%，wiernik等用此方法觀察到癌細胞的橋粒值遠小于正常細胞，提出這可能與癌細胞易于失去相互間的的細胞連接，從而形成轉移有關。用免疫細胞化學法顯示的神經纖維，在局部組織中可能出現縱橫交錯的復雜圖像，用圖像分析儀可獲得單位面積內神經纖維的總長度。又如去甲腎上腺素神經纖維呈串珠樣，如果測出一定范圍內神經纖維總長度及局部膨大數目，即可計算出串珠平均間隔距離，比較。
（三）面積
無論是在光鏡或電鏡免疫細胞化學標本的觀察中，都要涉及有關標本中某些結構的面積問題。即使是極不規整的結構，用圖像分析法容易算出其面積。在一定的放大倍數下，每μm2中含多少像素可以測出，畫出待測結構的輪廓，在所勾畫的范圍內含多少像素是立即可顯示出來的，這樣，很快可算出面積的數值。例如免疫電鏡技術中的鐵蛋白法、膠體金法等，可用上述方法進行單位面積中反應產物顆粒的計數，可進行各種實驗條件的比較。
曾有人在肝臟切片上進行圖像分析，在一定范圍內所有細胞核的總面積顯示為51554像素，其中肝細胞核總面積為27431像素，可知肝細胞核占全部細胞核總面積的53%。
四、圖像分析儀工作程序
使用者對硬件不需操縱，它們可完成復雜的運行過程，完整的計算機軟件可按實際需要使其執行功能。對操作者來說，圖像分析儀的實際操作很少，幾乎*是通過一個稱為光電鼠標（mouse）的附件來操縱的。計算機屏幕上顯示出多項指令，可由光電鼠標來指明你所需要的程序，光電鼠標可控制計算機屏幕上的一個光標，移動光電鼠標也隨著移動，將光標移到計算機屏幕上顯示的某項功能的區域內，就表示選擇了該項功能，可以開始工作，極簡便。圖9-1為圖像分析儀的簡化圖。
圖像分析儀主要包括輸入（input）、中央信息處理機（central processor）和輸出（output）三大部分。實際上，工作程序并不是一成不變的，后面的步驟的信息常會反饋到前面，于是又重復前面的程序，具體步驟如下：
1．標本成像 移動標本使需要觀察的部位在電視攝像機上得到適當放大的圖像，標本包括組織切片或電鏡照片或照相底片等。
2．圖像獲取 用電視攝像機或其他方法將圖像轉變為電信號，在此過程中，攝像機的性能極重要，不能使用那些便宜的適用于監視的電視攝像機，一定要用使圖像具有很好的清晰度的攝像機。
3．加強圖像 加強電子圖像（electronic image）使其更適合于分析。
4．檢測檢測（detection ）是圖像分析過程中設法從圖像中確定并且分離出需要分析灰度相的步驟，“相（phase）”是圖像中我們想要測量的部分的總稱。檢測是通過選擇一定的閾值來完成的，如果所需相比背景暗，那么所有暗于下限的東西都被選，例如相的灰度是20～50，20是下限，50是上限，背景的灰度小于20，檢定時暗于灰度20的東西都被選。如果所需相比背景亮，如免疫熒光細胞化學技術的標本，那么亮于上限的東西都被選。如果所需相比背景亮，如免疫熒光化學技術的標本，那么亮于上限的東西都被選，例如相的灰度是5～20，5是下限，20是上限，背景灰度大于20，所謂上限既指比灰度20淺的亦即灰度20以下的相被選，而背景是暗于上限的，不被選作測量。如果相暗于圖像某些部分而又亮于圖像的另一些部分，那就要在二限之間的部分選擇灰度了。
在檢測過程中要使用圖像框（image frame）和測量框（measurement frame）。檢測只在圖像框內進行，框的大小按需要而定，測量框在圖像之內，是進行測量的部位。兩個框之間的部分稱為保險區（圖9-2）。
圖像中每個被測物都有其*的特征計算點（feature count point, FCP）,FCP在被測物的點，如圖9-2中上面10個被測物的FCP均在測量框內，可計數或作其他測量，而下面2個被測物的FCP不在測量框內，則不計在內，在測其他區域時再計算，有的被測可能被測量框截斷，那么測量框外的那部分被測物應該位于保險區，即保險區要大于被測物，才能觀察FCP是否在測量框內而決定取舍。這樣當換到相鄰的區域進行測量時，不會使某圖形重復測量，可避免測量誤差，圖9-3顯示放置標本的顯微鏡載物臺的移動方式，可由計算機控制，用編制好的程序，使載物臺按一定方式移動，也可以人工操作。圖中可以看出每個部位都將通過測量框，不會遺漏。
圖9-2 示測量框位置，圖中有10個被測物的FCP在測量框內
5．陰影校正校正圖像細節 直到正確無誤并達到能被測量的要求。所謂陰影（shading）是指人眼看來是均勻的視場內存在著不均勻的電子反應，這使得灰度相同的圖像成分由于在視場中所處位置不同而顯示出不同的灰度，這種影響必須校正才能使圖像得到準確測量。陰影有三個主要的來源：
（1）圖像源的不均勻的光照。
（2）穿過透鏡時光路發生變化引起的透鏡陰影。
（3）顯像管本身的圖像靈敏度差異引起的掃描陰影。]
任何圖像分析在具體運用中都有這些陰影存在，前二者可通過精密安裝圖像分析儀來控制，后者可通過對顯像管的質量嚴格篩選來減少影響。陰影可貯存起來，并且在每上次掃描時同步地從圖像信號中去掉。
圖9-3 顯微鏡載物臺移動方式1.載物臺移動方向；
2.暈微鏡觀察視場；3.圖像框；4.測量框
6．測量經以上各步驟后，可以用圖像分析儀的計算機對圖像進行測量來取得所需的參數，如灰度、面積、長度、個數等。原始的參數可由計算機轉化成容易理解的數值，例如面積可由某圖形所占像素數轉化為平方微米，使觀察者容易理解。
7．資料分析 將資料進行分類，并加以說明，以便做出結論。也可將資料貯存，隨意可提取出來，供研究者使用。
8．其他事項
（1）標本要清潔：如果標本上有污點，研究者可分辨哪些是正常的免疫反應產物，哪些是污染引起的，但儀器不會區別，只要是電視屏幕上測量框內有的東西都會被測量，如測灰度時切片上有污點，會影響結果。
（2）電壓要穩定：這一點是結合我國目前情況而言，雖然儀器使用時是通過穩壓器的，也要經常注意穩壓器上的電壓指針是否穩定，否則也影響結果。
（3）價格問題：圖像分析儀廣泛應用于工業、農業、醫學等領域，因此并不是價格愈貴就愈好，而要看我們的應用目的及其性能，以免購置一些用不著的昂貴的附件而造成浪費。一般可以從以下三方面來考察儀器性能：在本專業范圍內應用的廣度、運算的速度和操作的方便程度。
（4）合作使用：分析儀價格昂貴，根據國內目前實際情況，有些工廠購置了圖像儀而僅僅用作工業金相分析，閑置的時間很多，我們從事醫學研究的人可以去充分利用它的性能，聯合進行科研工作，發四川省目前級的圖像分析儀就是在工廠中而不是在高等學校中。
五、沒有圖像分析儀可否進行圖像分析？
當沒有圖像分析儀時，研究者早已想到用網格來進行圖像分析，也獲得了客觀的評定結果。網格可分為兩大類：一類是置于目鏡內的網格，可測量切片標本上的各種數據；另一類是大的網格，可放在照片上，光鏡電鏡照片均可用，對照片上的各種結構可進行測量。以上二者至今仍被采用。英國標線片公司提供許多型號的市售標線片（即網格）。有的國家制造的顯微鏡，將目鏡與帶有六種不同型號標線片的旋轉盤裝在一起，以便于觀察者作各種測量。國內某些單位有自制標線片，并有少量出售。
Aalto等1982年曾在“免疫組織化學的形態測量法一卵巢腫瘤內的胚性癌抗原”一文中推薦用視野評分法，他用三種方法對PAP法免疫組化標本進行分析：①對全切片的染色進行分級。②在10×10放大倍數下，每一切片用目鏡網格任選25個方形視場進行觀察，并對每一視場進行分級。③在25個視場內取25個點的著色強度進行分級。染色強度分為0級、1級（輕度）2級、（中度）、3級（重度）。方法①的結果不同于②③，而方法②和③差別不大，說明主觀估算的鑒別能力低，一般鏡下觀察不能確切反映染色強度。
用網格進行圖像分析的方法很多，如用免疫熒光等方法顯示神經纖維，要表示各處的纖維密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用網格法就要客觀一些，在目鏡或照片上放上網格，觀察陽性神經纖維與網格上的線條的交叉次數，排列密集的區域交叉次數必然多些，這就比較客觀，重復性也較好。
用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標本，Ploem曾在1977年指出熒光強度之差至少要二倍才能在直觀估計時顯示出差別，說明人視覺對熒光強度變化不夠敏感。作者在工作中體會到，可利用照相的自動曝光系統來作相對定量，因為熒光愈強則自動曝光時間愈短，熒光弱則自動曝光時間長，相當敏感，用眼睛觀察二個熒光強度幾乎無差別的細胞，也能在自動曝光時間上顯示出差別來。作者曾經將許多熒光標本用相同的曝光時間拍在同一個膠卷中，沖洗后，熒光強的區域膠卷上顯色深，熒光弱的區域膠卷上顯色淺，因為熒光容易淬滅，用此法可將膠卷較長期保存，而且膠卷上的信息還可通過圖像分析儀測灰度等數據。這些都是在實踐中的一點經驗，供讀者參考。
用網格測量的具體操作舉例：圖9-4為一關聯方測格，由于測點、測線、測面之間有互相關聯的關系，故稱為關聯方測格。方格直線交叉稱為測點，總數為100個，方格中所有直線稱為測線，小方格邊長為d如圖中所示，測線總長度為200d,整個大方格為測面，測面總面積為100d2，測格周圍的虛線不是測線。關聯測格的優點是：只在計數位于欲測圖像中的測點數P，就可計算位于該圖像中的測線長度L及測面的面積A。計算方法為：L=2d·P，A=d2·P。
可將圖9-4攝制于小的透明膠片上，剪成你所用的目鏡筒的內徑大小，將其置于目鏡內，使測格清晰地疊映組織標本的圖像上，則可進行測量。d的長度可用臺微尺來確定。也可將9-4復印在較大的透明膠片上，可用來測量電鏡照片或光鏡照片，將透明膠片疊加在照片上即可進行測量。圖9-5為一測量的例子：
圖9－4 關聯方測格
圖9-5 示測點計數
此關聯方測格共有測點100個（如果只計數粗測點則有25個），圖像為一個腎小體的輪廓，包括血管球和腎小囊腔，測點計數的結果，在腎小囊腔內的測點數為12，在血管球內的測點為49個，整個腎小體內的測點為12+49=61個，用臺微尺測出d的長度，則可得到此圖像中腎小囊腔的面積，血管球的面積，腎小體的面積。明小囊腔與腎小體的面積比12：61=19.7%等多個參數。
值得提出的是，在顯微鏡下網格的線條有一定寬度，如圖9-6所示。計數測點時如①箭頭所示，即橫線上緣與豎線右緣交點處為真正的測點，若此點落在圖像外面則不能計數。如②箭頭所示，此測線的上緣才能作為真正的測線。
圖9-6 示真正的測點與測線
表面積密度的測定：免疫細胞化學電鏡照片中的膜性結構如內質網、線粒體、細胞膜等都可測定表面積密度，光鏡標本中的各種結構也可同樣測定。表面積密度是指單位體積參照空間內特征物的表面積，通過數學運算可簡便地用以下方法測定：測量單位面積參照面內特征物斷面周界線的長度。如果某一個細胞的電鏡照片作為參照面，線粒體作為特征物，欲測單位面積電鏡照片內線粒體斷面周界線的長度，可用以下公式：
SV=2IL
SV表面積密度2IL交點密度
IL=測線與特征物斷面周界線之間的交叉點數除以參照面內測線總長度。
圖9-7為一咱擺線測格，可用來方便地測表面積密度。圖中的平行直線不是測線，僅是為了便于計數交叉點和測點而畫上的。圖中的曲線即擺線，也就是測線，共45條，每條擺線長度d=1/10測格寬度(1cycloid arc =1/10×frame width) ，測格的寬度容易測量，如用目鏡測格，可用臺微尺測量，如用大的透明膠片，可實際用尺測量，因此每條擺線長度很易算出。測格中共有45條擺線，其總長為45d。圖中直角短線（L）示測點，共90個，測線長度L與測點數P的關聯關系為L=d/2·P。具體來說，用圖9-7擺線測格，置于一個細胞的超微結構照片上，如果整個測格均位于照片內，則參照面內測線總長度為45d,如果90個測點只有60個落至細胞內（即測格中有30個測點落在此照片外）則參照面內的測線總長度為d/2·P=d/2×60=30d。擺線與特征物（如內質網膜、線粒體的膜等）的交叉點容易數，用上述IL和SV公式即可得出所需參數。此公式為經過數學上的研究而得出，我們可應用公式來作表面積密度的研究。
讀者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的隨機切片。若特征物呈各向異性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一個組織塊中作三個互相垂直的切片（three mutually perpendiculer sections ）用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出，指垂直于某任意確定的水平面的隨機切片，或平行于某一任意確定的垂直軸的隨機切片。如圖9-8所示，HP為水平面（horizontal plane），VP為垂直面（vertical planes），二個垂直面互相不是平行關系，成一定角度。在生物組織中，如皮膚的表皮、各種上皮的外表面均可作為水平面，只要與水平面垂直的各個方向所切的切片均為垂直切片。骨骼肌纖維的長軸、長骨的長軸均可作為垂直軸，與其平行的切片也作為垂直切片。管狀的器官如消化管、呼吸管道等，可縱向剖開，展平，當作水平面，在其中作垂直切片如圖9-9所示：以水平面為基準，垂直切片必需在隨機的位置和隨機的方向，在標本計劃中，步是需要隨機，常用一組系統隨機位置的垂直切片（systematic randomly positioned vertical sections），個切面是隨機的，其余切面則是與個切面或一定的角度而選擇的，如圖中（3）和（4）即表示三個不同的方向，但都垂直于同平面，即垂直切片互相間有一定的旋轉角度。圖9-7擺線測格中大箭頭所示vertical 表示箭頭方向與標本垂直軸一致，即圖9-8中的verfical 所示方向。
如果有的標本沒有可辨認的垂直軸，可任意確定一個水平面，來作垂直切片。
圖9-7 示擺線測格
9-8 示垂直切片
VERTICAL：指垂直軸；
P：水平面；二個VP為垂直面，互相不呈平行關系
圖9-9 示管狀器官的垂直切片
六、實例介紹
因為將免疫細胞化學方法與圖像分析結合起來進行研究的論文在國內國外都還不多。在第六屆學術會議上發表的90多篇論文中只有1篇，因此在實例介紹中，包括一部分不是免疫細胞化學方法，而是用其他組織學方法與圖像分析結合起來研究，但這種方法對研究免疫細胞化學標本也可借鑒，從中可得到一些啟發的，也在此選擇性地作一些介紹。
Mcmillan等1983年在第六屆體視學會議上曾報告了“用圖像信息處理機客觀評定免疫組織化學染色的組織”，闡明了當組織與抗體作用時，不斷攪動血清，明顯提高了免疫反應。Bordier 等1982年用圖像分析法對大鼠的神經垂體進行研究，闡明了軸突占神經垂體體積的一半，分泌顆粒占軸突體積的20%，加壓素的含量與分泌顆粒的體積密度無關，而與分泌顆粒內激素濃度有關。這些結果如不用圖像分析法是很難得出的。Steward等1983年用測量家雞腦單位面積內的突觸數目等，來研究與記憶形成有關的細胞學改變。
英國現在有300萬75歲以上的人，其中有五十萬人患有老年性癡呆（Alzheimer病），這種病過去認為是由于年齡增長的不可避免的現象。英國神經科學所用圖像分析儀與谷氨酸鹽受體的放射自顯影法結合起來對此病進行了重要的研究。由于放射自顯影會產生一些非特異性的結合，用圖像分析儀可以從全結合圖像減去非特異性結合圖像，而得到特異性結合圖像，可以測出特異性結合的百分率。目前已知道，老年性癡呆患者腦中，與記憶、理性行為及感情行為有關的區域內，神經元的進行性退變，神經遞質發生改變，影響了從一個神經元到另一個神經元的信息傳遞。
我國1991年11月出版的“計量學在形態學研究中應用學術研討會論文集“共收集論文123篇，其中有關免疫細胞化學與計量學結合的論文共8篇：①大鼠燙傷后下丘腦室旁核和視上核內AVP含量變化的形態學計量（第二軍醫大學張忠義等）用圖像分析儀測定AVP陽性反應物的面積。②人脊神經節 內SP、SK、CGRP免疫反應細胞的比率（中國醫科大學方秀斌等），用人工計數方法。③交感神經元和膽堿能神經元中ACh和ChAT顯示比較（軍事醫學科學院汪家政等），用圖像分析法測定各種參數。④大鼠脾樹狀突細胞的組織分布棗S—100蛋白標記和立體計量分析（南京鐵道醫學院張錦堃等）用目鏡標線片的測格進行定量研究。⑤垂體GH腺瘤細胞分泌顆粒的免疫膠體金定位檢測及定量分析（中國人民總醫院羅毅等），用圖像分析法測定各種參數。⑥胃腸粘膜重度異型增生與腺癌細胞核DNA含量的測定及免疫組化的比較研究（上海第二醫科大學吳平平等），用顯微分光光度系統進行DNA測量。⑦免疫組化在胃癌病理棗生物學分型中的價值（濱州醫學院張樹畢等），將免疫組化反應分為陽性陰性而進行比較。⑧人胎十二指腸EC細胞的體視學研究（江西醫學院朱清仙等）用目鏡標線片測格進行定量研究。由此可大致體現我國在此領域的研究現狀。
七、圖像分析與體視學
圖像分析還可用于三維重建，用連續切片可重建立體的原形，在神經組織的研究中很適用。我們在顯微鏡下觀察到的是平面圖像，而這些平面圖像是從立體結構中切下來的，單憑平面圖像不能反映組織的真實結構，例如圓形可以從球形、圓柱形、橢圓形物體中切下。如何從二維結構推導出三維結構，這就是所謂體視學（stereology）所研究的范疇。stereology 這個詞是1961年開始正式應用的，由于體視學與圖像分析的密切關系，無論是上的或國內的學術會議都將這二者放在一起討論。
將體視學知識與免疫細胞化學標本觀察聯系起來，將是一種可以獲取更多信息的研究手段，目前國外已很重視體視學的研究方法，發表了一些論文，國內也開始做這方面的工作，因此有必要將體視學的一些基本術語介紹給讀者，供參閱文獻時或自己進行研究時應用。體視學語言目前已是一種通用的術語，現將常用的介紹如下：
結構（structure）：在一個確定的組織模式中，由許多相互依賴的部分所組成的某物體稱為結構。一個結構至少有二個組分構成，體視學的目的即弄清楚各組分之間相互關聯程度、相對大小等。
組分（component）：在結構中能被截然分開而且能被辨認的部分。
相（phase）：所有在本質上相同的組分的集合稱為相。例如一個細胞的所有線粒體構成了此細胞的線粒體相。
粒子（partiele）：假如組分是由許多離散的并且能夠作為單元獨立存在的要素所組成，則將這些要素稱為粒子，粒子可以表現為各種形狀。
凸面體（convex solid）：連接此實體內任何兩點的線段，必需全部落于此實體內，換句話說，即此實體上切下的一個切片只能形成一個截面。
包容空間（containing space）：指包含被研究的組分的空間。當然，被研究的組分常與其他不被研究的組分并存。
密度（density）：單位體積、單位面積或單位長度內的量。
體積密度（volume density）：在單位包容空間內，某相的體積。
表面積密度（surface density）：單位包容空間內所含有某相的表面積。
長度密度（length density）：單位包容空間內某相的長度。
數密度(numerical density)：單位包容空間內某相的數目。
截面（profile）：任何結構的切片上的圖像。
體視學的測量值往往是相對測量值，以兩個彼此相關聯的測量值的比率來表達，其中一個測量值與組分有關，另一個測量值與包容空間在關，后者也稱為“參考系統”。體視學原理可確定在切片上測得的這些比率與空間結構內相應的比率之間的關系。上述性質反映在體視學符號中，而這些符號目前已普遍被使用，在有些文獻中已不再作解釋了。常用的符號如下：
P測試點數
P1單位測試線長上的交點數
Pa單位測試面積上的點數
Pv單位測試體積上的點數
L測試線長
L1單位測試線長上的截距
La單位測試面積上線的單元長
Lv單位測試體積上線的單元長
A測試面積
S表面積
Aa單位測試面積上被測物的面積
Sv單位測試體積內被測物的表面積
V體積
Vv單位測試體積內被測物的體積
N被測物數目
N1 單位測試線長上與被測物相交的數
NA單位測試線長上與被測物的數
Nv單位測試體積內被測物的數
用測試網格的體視學方法，楊光等，1987年曾對腹腔神經節 小強熒光細胞進行超微結構的定量分析，測量了線粒體、溶酶體、粗面內質網、顆粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等參數，得出了標準小強熒光細胞的計量值。此處的Vv即單位體積細胞質內某種細胞器的體積，據體視學原理，Vv等于切片上被測的某種細胞器所占的面積的均數a與細胞質的面積的均數A之比，如用圖像分析儀即可得出此二者的面積，而用測試格a等于落在此細胞器上的測試格的交點總數∑Pi，A等于落在細胞質上的測試格交點總數∑Pc。
Vv=ā／A=∑Pi/∑Pc
測試格的交點數有各種規格，如果有20條橫測試線與20條縱測試線組成的測試網格，則有400個交點，利用交點所落部位進行推算。
免疫組織化學形態計量研究中參照空間的“陷井”問題。在某種組織結構（參照空間）內測量特征物的密度值（如體積分數、表面積密度、長度密度、數目密度等），如果不知道參照空間的體積，得不到值，就有可能作出錯誤的結論，就是參照空間的“陷井”。舉一例子說明：實驗的結果對大鼠肝細胞中的內質網的體積分數和表面積密度無顯著差異，如果依此就認為苯巴妥對肝細胞（參照空間）內質網無顯著影響，就錯了，就進入了參照空間的“陷井”中去了。實際上，在些實驗條件下，肝細胞質總體積顯著增加，因而雖然內質網的體積分數和表面積密度無顯著差異，但其值已顯著增加了。因此，要測量或估計參照空間的體積、乘以密度值，獲得值，才能獲正確的結論。
八、國內外生產圖像分析儀的情況簡介
（一）國內情況
80年代初，以IBM—PC為代表的個人計算機得到了突飛猛進的大發展和在普及；緊接著各種功能強大面向圖像處理與分析的超大規模（VLSI）蕊片或單板達到商品化水平，兩者的結合，為微機圖像處理系統的問世奠定了硬件基礎。打破了以往只能在大中型計算機加圖像處理系統的構成價格昂貴的圖像處理系統的局面。為推廣圖像處理與分析技術創造了物質基礎。從80年代中期開始，國內先后有武漢大學、清華大學、中科院自動化所、計算所、重慶大學、四川大學、華北計算所等單位，紛紛進行微機圖像處理與分析系統的研制和推廣應用工作。其中以四川大學計算機系圖像圖形研究所研制開發并定型生產的MIAS系列圖像分析儀在國內具有較大的優勢，獲得了1992年新產品證書。
現介紹如下：MIAS系列圖像分析儀包括偽彩色型MIAS—300，真彩色型MIAS—400，超高分辨率型MIAS—1000等面向生物醫學、金相分析、石油地質以及其它目的的各種圖像儀均由硬件系統和軟件系統兩大部分構成。硬件系統主要包括MIAS圖像處理計算機、圖像輸入設備，圖像輸出設備和交互式處理設備等。其主要性能指標：圖像分辨率512×512，640×480，1280×1024。圖像采集速度：電視方式0.04s/幀，慢速高精方式2～10秒/幀。圖像存儲體：MIAS—3000.5MB～1.5MB（兆字節 ），MIAS—4001.5MB～4.5MB,MIAS—1000 2MB～10MB 。灰度等級：256或4096。圖像處理器特性：IPU40MHZ主頻，>10MIPS。IFU（圖像浮點處理器）40MHZ主頻，>4MFOPS（每秒兆浮點處理指令）。在各種圖像輸入設備中，以視頻攝像機為圖像的基本輸入設備，也可以配接視頻錄像機、數字掃描儀和連接掃描電鏡的接口。高分辯彩色監示器為圖像的基本輸出設備。該系統還具備有自動移位的載物臺和自動聚集控制系統可供用戶選擇。MIAS系列圖像分析儀的軟件系統是在DOS（磁盤操作系統）3.2以上環境開發的，全部采用C語言和匯編語言（80286宏匯編，TMS340系列匯編）進行編程，共98個功能模塊。主要功能包括初始化及環境設置、圖像輸入和輸出、圖像編輯、圖像增強、圖像分割、圖像測量、實用程序等。測量參數包括一維和二維目標的各種形態參數，灰度參數和紋理參數等數十種。該系統在長期為華西醫科大學、和第四軍醫大學、北京軍事醫學科學院、上海醫科大學、湖南醫學院、哈爾濱醫科大學等數十個醫學單位的服務中，積累了許多有效的實用算法和功能、用戶界面和處理速度方面已達到和超過某些進口中圖像儀的水平。
（二）國外情況
英國的主要生產廠家有劍橋儀器公司（Cambridge Instruments Company），在圖像的測量、計算、比較、分類等功能上都比過去的產品更完善，使用了大功率的新型計算機，使用QUIPS程序可獲得各種圖像分析測量的數據，重現性好。操作者不必精通程序設計語言，只需接受幾小時使用QUIPS語言的教學訓練即可。
英國Ealing—Beck公司生產Histotrak圖像分析系統，如用透射光，該儀器能自動改變放大倍數。具有陰影校正系統。使研究工作者感興趣的是該儀器中設有坐標發生器，能使被檢圖像的坐標數據通過臺式計算機在輸出打印機上打印出來。
英國Micro Measurements 公司生產電視掃描圖像分析儀，成本較低，用途較多。
英國Joycez—Loebl公司生產Magiscam圖像分析系統，操作較簡單，可解決一般圖像分析問題，并可進行彩色圖像分析，在醫學和放射學等方面適用。
美國的主要廠家有美國美敦設備公司（Milton Roy Company），生產OMNICON圖像分析儀，據上海多國儀器儀表展覽會資料介紹，Ommicon圖像分析系統有Omnicon Alpha500用于常規檢驗和研究。Ommicon FAS—III 用于醫學和生物學領域較合適。Omnicon 3500為一種多用途的系統，配有64K通用NOVA4×計算機。Omnicon 5000是該公司發展的使用起來方便的定量圖像分析儀。Omnicon 7500是為了對圖像作實時分析而設計的產品。
德國Leitz公司制造Leitz T.A.S圖像分析儀，圖像輸入裝置是一臺Leitz Orthplan顯微鏡，該儀器還包括一臺TU—58雙盒式磁帶機，可用于存貯程序、數據、圖像。該公司產品的新型號是Leitz T.A.S PLUS，增加了自動調焦、自動圖像旋轉等功能。
德國Carl Zeiss公司的產品是Micro—Videomat，主要優點是有適用于計算機和大型計算機的程序。型號有Micro Videomat 2型、3型等。
德國的OPTON公司生產IBAS2000圖像分析系統，可應用于顯微圖像分析的所有領域，如放射自顯影、染色體分析、真色圖像信息、細胞學分析、用連續切片來重建原形、顆粒大小分析、纖維分析、可測定交叉的或重疊的纖維長度及纖維的長/寬比例等。
德國VEB Zeiss Jena公司生產EPIQUANT圖像分析儀，可進行自動或半自動分析。
日本浜板電視公司生產一系列特殊用途的、測量特殊參數的自動分析系統，如其中有一種稱為Multianalyser的，與顯微鏡相結合，可用來測面積、長度等。
對國內外資料收集比較局限，總之購置儀器時要充分了解性能、對價格作比較、才能獲得滿意的結果。
參考文獻
1．Jenkinson G. An introduction to the operation and capabilities of image analysis systems.International Labmate, 1987：12(3～4)
2.Weibel ER. Stereological methods –practical methods for biological morphometry. London：Academic Press,1979
3.McMillan PJ. Objective evaluation of immunohistochemically stainned tissues using an image array processor. 6h International congress for Stereology, 1983
4.Aalto ML, et al . Morphometric approach to immunohistochemisiry：carcinoembryonic antigen(CEA)in ovarian tumours. Acta Stereologica, 1982；1(2)：347～356
5.Boudier JA. et al. Stereological analysis of the rat neurohypophysis. Acta Stereologica, 1982；1(2)：323～328
6.Steward MG, et al. Stereologlcal analysis of synapses in the brain of the domestic chick following avoidance learning. 6th International Congress for Stereology, 1983
7.Cambridge Instruments Issue 2, 1987
8.Wiernik G, et al. A quantitative comparison between normol and carcinomatous squamous epithelia of the uterine cervix, British Journal of Cancer, 1973；28：488
9.楊光，等.豚鼠腹腔神經節 小強熒光細胞超微結構的定量分析.*四屆體視學與圖像分析學術會議論文匯編(集),1987]
10. 孫培懋,等譯.圖像分析入門.北京：計量出版社,1983
11. 管汀鷺譯.顯微術中的分析與定量方法.北京：科學出版社,1983
12. 楊正偉.生物組織的形態計量研究中應特別注意的兩個問題：參照空間的“陷井”和樣本含量問題.川北醫學院學報,1992；7(3)：73～76
13. Crus - Orive LM, et al：Recent stereological methods for cell biology：abrief survey. Am J Physiol, 1990；258(Lung Cell/Mol . Physiol. 2 )：L148～L156
14. Baddeley AJ, et al.：Estimation of surface area from vertical sections. J of Microscopy, 1986；142：259～276
15. Mattfeldt T, et al. Orthogonal triplet probes：an efficient method for unbiased estimation of length and surface of objects with unknown ori－entation in space. J of Microscopy, 1985；139(3)：279～28