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小鼠角質細胞的分離和培養
閱讀：367 發布時間：2018-12-10實驗方法原理
將人滑膜從機體中取出，經胰酶、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細胞，置α-MEM生長培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖。
實驗材料 滑膜組織
試劑、試劑盒 Ⅰ型膠原酶胎牛血清生理鹽水PBS
儀器、耗材 超凈臺解剖剪過濾網離心管記數板培養瓶
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. 滑膜組織：將外科手術切下的組織在手術臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中，在手術完成時將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室。
2. 試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養液(含10%胎牛血清的α-MEM)。
3. 器械：手術器械。
二、方法
1. 將切下的組織在手術臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中(靜止)，在手術完成時將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室。
2. 在超凈臺中將標本放入培養皿中，加入α-MEM洗滌。
3. 獲得組織切開，仔細辨認于關節反折處及增生的白色光滑的滑膜組織，附于關節軟骨面的增生的血管翳也為滑膜組織(可作另一管消化)，仔細剔除脂肪組織，用α-MEM洗二次(以去除紅細胞)，放在小青瓶中用解剖剪銳性切碎。
4. 用雙倍獲得組織的體積含有4 mg/mlⅠ型膠原酶的α-MEM消化37℃孵育120分鐘(在此期間震動混勻數次)。
5. 30分鐘后收集管細胞：細胞懸液經70 μm細胞濾網過濾，用1500-2000轉離心6分鐘，上清為Ⅰ型膠原酶加入未過濾網的組織，繼續用于消化。
6. 離心管底細胞用α-MEM離心洗滌2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000轉，離心6分鐘，后一次用記數板觀察到有細胞。細胞終懸浮于含有10%胎牛血清的α-MEM中，接種到培養瓶中培養。
7. 60鐘后收集第二管細胞：細胞懸液經70 μm細胞濾網過濾，用1500-2000 rpm離心6分鐘；用α-MEM洗2次，每次用α-MEM重懸浮后用1500-2000 rpm離心6分鐘，后一次用記數板觀察細胞并計數。細胞終懸浮于α-MEM含有10%胎牛血清中，接種到培養瓶中培養。
8. 必要時可做第三管細胞收集；并立即作原代滑膜細胞培養。
9. 每2-3天換液一次。
收起
注意事項
1. 全培用α-MEM或RPMI1640或DMEM，加10%胎牛血清。不能用小牛血清，胎牛血清用國產即可；
2. 必須用Ca2+-free的PBS。
其他
實驗材料準備
1. 滑膜組織：將外科手術切下的組織在手術臺上請護士將標本放入低溫生理鹽水中，在手術完成時將標本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中帶回實驗室。
2. 試劑：4 mg/mlⅠ型膠原酶(α-MEM配制)，培養液(含10%胎牛血清的α-MEM)。
3. 器械：手術器械。