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人臍帶靜脈內皮細胞的分離培養與增殖實驗
閱讀：867 發布時間：2019-1-25血管內皮細胞不僅參與調節血管通透性和凝血過程，在免疫調節，移植排斥，腫瘤轉移，炎癥等許多過程中也具有重要作用。內皮細胞培養是體外研究內皮細胞功能的重要手段。70年代Eric等建立了內皮細胞分離及體外培養的方法。實驗方法原理 在體外，內皮細胞在內皮細胞生長因子存在的條件下可迅速增殖，并可傳代，可作為內皮細胞增殖，細胞因子分泌、表型等研究的模型。
實驗材料 膠原酶血清
試劑、試劑盒 Cord Buffor硫酸鏈霉素生埋鹽水EDTA-Na明膠
儀器、耗材 插管止血鉗注射器手套絲線飯盒勻漿機離心機振蕩器培養瓶CO孵箱顯微鏡超凈工作臺孔板
實驗步驟
一、臍帶內皮細胞的分離
1. 臍帶收集
用無菌止血鉗夾閉臍帶兩端，在止血鉗外側剪斷臍帶，放入盛有4 ℃Cord Buffer的飯盒內。臍帶在4 ℃放置不應超過24 小時。
2. 臍帶內皮細胞分離
（1）帶無菌手套，取出臍帶，在止血鉗內側用碘酒和酒精棉球消毒后，用無菌剪刀將兩端臍帶剪除。
（2）在臍帶一端找到靜脈，插入臍帶靜脈插管，用2 根粗絲線扎牢，用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器沖洗靜脈腔，至將臍血洗凈。
（3）趕出靜脈腔內殘余液體，將臍帶另一端用止血鉗夾閉，用10 ml注射器連接針頭，注入37 ℃預熱的0.1 ％膠原酶約6-8 ml，放入37 ℃ Cord Buffer中保溫6-10 min。
（4）吸出靜脈腔內膠原酶所消化的細胞懸液，加入預加有20 ml Cord Buffer的離心管中，沖洗靜脈腔，一并加入離心管中。
（5）離心，1500 rpm，10 min棄上清，用5～7 ml 20 ％FCS，RPMT 1640重懸細胞，轉入培養瓶，放5 ％CO孵箱。
二、牛下丘腦內皮細胞生長因子粗提物的制備
1. 取新鮮牛下丘腦，加1.5倍體積的冰生理鹽水用組織勻漿機勻漿，每次0.5 min，共6次。
2. 在4 ℃條件下用震蕩器機械震蕩約1.5 h。
3. 離心，10000 g，40 min，收取上清液。
4. 按0.5 ％加硫酸鏈霉素，4 ℃過夜。
5. 離心，20000 g，40 min，收取上清液。
6. 用紫外分光光度測280 nm，260 nm OD值按公式計算蛋白含量。
7. 過濾，分裝，-20 ℃保存備用。
三、內皮細胞的培養與鑒定
1. 培養瓶包被明膠
培養瓶（25 cm）中加入0.2 ％明膠3 ml，使其鋪滿瓶底，放4 ℃備用。用前棄去明膠溶液。
2. 原代培養
將從臍帶靜脈中收集到的內皮細胞移入包被明膠的培養瓶（25 cm），加5～7 ml 20 ％小牛血清199培養基，按終濃度分別為20 μg/ml和100 μg/ml加入內皮細胞生長因子粗提物和肝素。每3～4 天換液1 次。
3. 傳代培養
待內皮細胞生長鋪滿瓶底后即可傳代。吸去培養基，用無血清RPMI1640 2 ml洗培養瓶1 次。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml，放37 ℃孵箱。待鏡下見大多數細胞卷縮變圓，可加入含血清培養基3 ml，以終止胰酶的消化作用，用彎頭滴管吹打。收取細胞懸液，加入離心管中，離心1500 rpm，10 min。棄上清，以*培養基重懸細胞，移入培養瓶擴大培養。
4. 內皮細胞鑒定
光鏡下內皮細胞為多角形或梭形，可見1～2 個清晰的細胞核。透射電鏡下， 部分內皮細胞中可有特征性的Weible-Palade小體存在。間接免疫熒光染色，內皮細胞為ⅧR∶Ag陽性。
四、牛下丘腦內皮細胞生長因子粗提物活性的測定
1. 0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收獲內皮細胞，計數，調整細胞數至5×104 /ml。
2. 細胞懸液加入包被明膠的96孔板，每孔100 μl，5×103個細胞。
3. 放置于5 ％CO孵箱，24 h，待細胞全部貼壁生長。
4. 每孔加待檢樣品100 μl，每個稀釋度設3個復孔，并設培養基陰性對照。
5. 放5 ％CO孵育，48～72 h，待陰性對照與陽性有明顯差別時，加3HTdR，每孔0.5 μci/50 μl。
6. 放5 ％CO孵箱，繼續培養12 h。
7. 細胞收集儀收集細胞，檢測Cpm值可計算刺激指數。
收起
注意事項
1. 嚴格無菌操作，防止在分離、培養和傳代內皮細胞過程中發生污染。
2. 膠原酶消化時所需濃度，時向要進行預試。如膠原酶濃度過高，內皮細胞容易死亡；濃度過低，則細胞收獲量低。
3. 內皮細胞應進行鑒定，以防將成纖維細胞誤認為內皮細胞。