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staurosporine誘導的細胞凋亡
閱讀:1368 發布時間:2019-2-19Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)強有力的抑制劑。通過阻斷磷酸二酯鍵從DNA轉移到活化的酪氨酸位點而直接抑制拓普異構酶II的活性。可用于誘導CHO細胞凋亡。
實驗方法原理 Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶(包括酪氨酸蛋白激酶)強有力的抑制劑。通過阻斷磷酸二酯鍵從DNA轉移到活化的酪氨酸位點而直接抑制拓普異構酶II的活性。可用于誘導CHO細胞凋亡。
實驗材料 妊娠的C57BL 6cr小鼠
試劑、試劑盒 staurosporine蒸餾水脫氫酶ZVAD-fmkLDH試劑盒Caspase3試劑盒膠原酶Ⅱ醌氯化鋇細胞計數試劑盒STSTrypsinEDTA DIDSNPPB
儀器、耗材 顯微鏡試管離心管移液槍離心管盒冰盒冰箱培養箱離心機載玻片蓋玻片
實驗步驟
一、原代心肌細胞的培養及實驗方案
1. 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心臟,按改良的Lader方法進行細胞的分離。 獲取博動的心臟迅速放置于無Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡液中。
2. 剪碎心臟,放置在4℃條件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h,用Trypsin抑制劑中止消化。
3. 然后在37℃下,用膠原酶Ⅱ于CO2培養箱內,在搖床上繼續孵化消化45~60 min。
4. 后用70 μm直徑尼龍過濾網過濾獲取心肌細胞,用含有25 mmol/LHCO3-,100 mL/L FSB,1×105 u/L青霉素G和50 g/L鏈霉素的M199培養基制成細胞懸液,按差速貼壁分離法純化心肌細胞。
5. 加入10 μmol/L BrdU到細胞懸液,以6×105密度種植于96或24孔細胞培養板上,置37℃培養箱培養。
6. 培養的心肌細胞24 h后更換含有10 μmol/L BrdU新鮮M199培養基,培養72 h后進行實驗使用。
7. 設立陰性、陽性對照及實驗組,每組20孔;陽性對照加入4 μmol/L STS,實驗組中加入4 μmol/L STS后再分別加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB,100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h,更換新鮮M199培養基繼續孵化4 h后進行各種指標的檢測。
二、細胞存活試驗
1. 按照實驗方案處理后的培養心肌細胞,每100 μL培養基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h,用分光比色儀進行檢測,實驗結果以細胞存活率表示,細胞存活率=A試驗組/A對照組×100%。MTT法A值既能反映心肌細胞內線粒體脫氫酶活性,又能間接反映心肌細胞的增殖與存活情況。
三、凋亡瓊脂糖凝膠電泳檢測
1. 收集24孔板處理過的細胞,棄上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase細胞裂解液(10 μmol/L Tris·HCl,0.1 mol/L EDTA,5 g/L SDS),37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K繼續孵化。
2. 1 h后加入等體積的酚、異丙醇(25∶24∶1)充分搖勻,離心取上清再加入等體積的抽提1次,轉移的上清液中再加1/10體積3 mol/L醋酸鈉及兩倍體積的無水乙醇過夜后離心,700 mL/L的乙醇洗滌后,TE液溶解DNA,于20 g/L含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳,紫外透射儀下觀察、記錄拍照。
三、Caspase3活性的檢測
使用ApoONETM Homogeneous Caspase3試劑盒檢測Caspase3活性。實驗設立空白、陰性對照及實驗組,含有100 μL培養基的實驗細胞中,加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和緩沖液,在室溫下輕微搖動孵化6~8 h,用熒光檢測儀于激發波為485 nm,散發波長538 nm處,讀取檢測熒光值.
四、心肌細胞膜完整性檢測
細胞培養上清乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測,LDH能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸與2,4二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中呈棕紅色,通過比色可求出酶活力。取細胞培養上清50 μL,反應后490 nm處測A值。
收起
注意事項
1. 嚴格進行消毒.使用三套器械取材。
2. 嚴格進行無菌操作,防止細菌、真菌、支原體污染,避免化學物質污染。
3. 吸取液體前,瓶口和吸管進行火焰消毒;經火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時,避免瓶口和吸管接觸碰撞。
4. 離心管入臺前,管口、管壁應消毒。