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PCR-SSCP 技術實驗
閱讀：763 發布時間：2019-3-18聚合酶鏈式反應-單鏈構象多態（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術可用于：（1）癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測；（2）遺傳病的致病基因分析；（3）基因診斷，基因制圖等領域。
實驗方法原理 PCR-SSCP技術的基本原理是PCR擴增后的DNA片段經變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構象，其構象直接影響泳動速率，相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產生立體構象的不同，造成泳動速率的不同，產生不同的泳動帶。PCR擴增后的DNA片段經變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質必須經過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
實驗材料 樣本DNA
試劑、試劑盒 Taq DNA聚合酶PCR反應緩沖液引物dNTPs丙烯酰胺TBE緩沖液過硫酸銨TEMED甲酰胺上樣緩沖液固定液銀染液顯色液
儀器、耗材 電泳儀水浴鍋電泳槽
實驗步驟
一、PCR反應
20 ml反應體系成分如下：
模板DNA（100 ng/ml） 1 ml
10×PCR反應緩沖液 2 ml
Taq DNA聚合酶（5 U/ml） 0.2 ml
4×dNTPs（2.5 mmol/L） 1 ml
MTHFR上下游引物 各 1 ml
ddH2O 加至終體積 20 ml
PCR反應循環參數：
95℃ 5 min；
94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30個循環；
72℃ 7 min。
反應結束后，置4℃保存。
二、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
1. 制備6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠：30%聚丙烯酰胺（交聯度49:1）10 ml，5×TBE緩沖液10 ml，加蒸餾水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%過硫酸銨250 ml，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠*聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入電泳緩沖液（1×TBE），緩沖液應高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。
2. 取5 ml 擴增產物加10 ml變性上樣緩沖液混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴。
3. 取5 ml混合液加到點樣孔中，以1——8 V/cm電泳4——5 h。
三、聚丙烯酰胺凝膠染色
1. 拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個塑料盤內，用蒸餾水沖洗1——2遍。
2. 倒入固定液，固定8——10 min。
3. 用蒸餾水沖洗1——2遍；倒入銀染液，銀染10——12 min。
4. 用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現清晰的銀染帶。
5. 用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀察PCR-SSCP結果。
四、結果判斷
觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上的DNA單鏈帶，根據異常泳動變位篩查突變樣本。
收起
注意事項
1. 靶DNA序列長度不宜過長，否則靈敏度下降。
2. DNA樣品在電場中泳動的長度一般要求在16——18 cm以上。
3. 染色在塑料盤中進行。
4. 環境溫度越高，聚丙烯酰胺凝膠越易凝固。應根據環境溫度的變化調整
凝膠中10％過硫酸銨與TEMED的用量。
5. 電泳過程中應保持恒溫，使用薄的凝膠和冷卻系統以散發熱量。
6. 用AgNO3染色時，染色時間需隨環境溫度變化作適當調整，環境溫度越
低，所需的染色時間越長。
7. 顯色時間不可過長，以免背景過深影響結果觀察。