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細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)之Annexin-V-FITC 單染法
閱讀：1794 發(fā)布時(shí)間：2019-3-19Annexin-V-FITC 單染法
實(shí)驗(yàn)方法原理細(xì)胞凋亡或稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細(xì)胞的生命現(xiàn)象之一，它在機(jī)體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的清除等方面起著十分重要的作用。細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的失控可導(dǎo)致臨床各種疾病的發(fā)生。如老年性癡呆與神經(jīng)細(xì)胞凋亡過度有關(guān)，自身免疫性疾病和腫瘤與細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。細(xì)胞凋亡有別于細(xì)胞壞死，它有一系列的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)的改變，包括出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、DNA降解、凋亡小體形成等。在正常的活細(xì)胞，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine， PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞，PS 從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。因此將Annexin-Ⅴ進(jìn)行熒光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-Ⅴ作為探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
實(shí)驗(yàn)材料Annexin V-FITC
試劑、試劑盒標(biāo)記緩沖液PBS去離子水冰塊
儀器、耗材移液器吸頭微量離心管可調(diào)速離心機(jī)載玻片蓋玻片流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 凋亡細(xì)胞的制備
小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg體重，10 h后解剖取胸腺，分離胸腺細(xì)胞。用PBS洗兩遍，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為2×106 /ml，備用。
2. 200 μl細(xì)胞懸液加入1 ml冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，1000 rpm 4 ℃離心10 分鐘，棄上清。
3. 重復(fù)步驟2兩次。
4. 將細(xì)胞重懸于200 μl 標(biāo)記緩沖液。
5. 加入10 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 分鐘或4 ℃反應(yīng)30 分鐘。
6. 加入300 μl標(biāo)記緩沖液，立即上機(jī)（流式細(xì)胞儀）檢測(cè)。
收起
注意事項(xiàng)
1. 整個(gè)操作過程動(dòng)作要盡量輕柔，切勿用力吹打細(xì)胞，盡量在4 ℃下操作。
2. 反應(yīng)完畢后要盡快檢測(cè)，因?yàn)榧?xì)胞凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，反應(yīng)一小時(shí)后熒光強(qiáng)度就開始衰變。
3. Annexin V-FITC是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)要注意避光。
收起
其他
一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
用熒光顯微鏡觀察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上可見黃綠色光環(huán)。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是調(diào)亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。以FITC標(biāo)記的Annexin V, 可以同時(shí)結(jié)合使用PI（碘化丙啶）拒染法，用流式細(xì)胞儀分析可檢測(cè)凋亡細(xì)胞的百分率。