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細胞凋亡檢測實驗之DNA 斷化檢測
閱讀：1358 發布時間：2019-3-19實驗方法原理 細胞凋亡時主要的生化特征是其染色質發生濃縮, 染色質DNA 在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300 kbp 長的DNA 大片段, 或180~200 bp 整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜（DNA ladder）。細胞經處理后，采用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA 后，用32P-ATP 和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA 標記，然后進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder 的形成。
實驗步驟
一、大分子染色體DNA 段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300 kbp 長的DNA 大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA 分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA 的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA 像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300 kbp 長的DNA 大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常采用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變后，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向后，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA 分子變換方向的時間小于電脈沖周期時，DNA 就可以按其分子量大小分開。
二、DNA Ladder 測定
細胞凋亡或稱程序性細胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是細胞的生命現象之一，它在機體的胚胎發育、組織修復及自身反應性T淋巴細胞的清除等方面起著十分重要的作用。（來源：免疫學實習指導——北京大學醫學部基礎醫學院免疫學系）
收獲細胞（1X107）沉淀?細胞裂解液13000 rpm′5 min, 收集上清1%SDS和RnaseA（5 mg/ml）56 °C，2 h。蛋白酶K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h，1/10 體積3 M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉淀DNA，4 °C過夜。14000 rpm′15 min后將沉淀溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer 1.2 %瓊脂糖凝膠電泳，EB染色并照相。
三、凋亡細胞DNA 含量的流式細胞計分析
收集細胞，70 %冷乙醇（in PBS）4 °C 固定過夜，PBS 洗滌，1000 rpm′10 minRNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化30 min PI（50 mg/ml）染色，室溫避光15 min，FACScan 分析DNA 亞二倍體的形成及細胞周期的變化。
四、ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
敏感度高，適合于檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。