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氯霉素乙酰基轉移酶（CAT）測定實驗
閱讀：1026 發布時間：2019-4-29通過測定轉染細胞的報告基因表達，如β-gal或CAT,可以確定導人的DNA是否已被整合到宿主細胞主要用于（1）測定基因表達（2）基因整合評價（3）細胞的調控。
來源于《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》
實驗方法原理
氯霉素乙酰轉移酶報告基因(chloramphenicol acetyltransferase, CAT)能將乙酰基從乙酰輔酶A轉移到氯霉素上。本試劑盒采用熒光測定的方法，檢測CAT活性，它的靈敏度接近同位素測定方法，而操作極為簡便、快捷，成本也大為降低。使用通用裂解緩沖液，能與其他類型的報告基因檢測和蛋白含量檢測兼容。
實驗材料 細胞樣本
試劑、試劑盒 Tris-緩沖液 Tris （Triton） CAT 稀釋緩沖液CAT 酶標準物閃爍液 聚丙烯閃爍杯
儀器、耗材 微量離心管微量離心機
實驗步驟
一、材料
滅菌物品
1. D-PBSA
2. 多孔培養板：6 孔，35 mm
非消毒物品
1. Tris-緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0
2. Tris/（Triton）：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，0.1%TritonX-100,4℃ 儲存
3. CAT 稀釋緩沖液：Tris-HCl，0.1mol/L，pH8.0，50% 甘油，0.2%BSA
4. 底物：含 250 mmol/L 氯霉素（GIBCO）的 甲醇；分裝，-70℃ 儲存
5. 14C-CoA：14C-丁酸輔酶 A（10uCi/mL；AmershamPharmacia）
6. CAT 酶標準物：制備含 0.2、1.0、2.0、4.0、10U/mL 標準液的 CAT 稀釋緩沖液，4℃ 儲存
7.「雞尾酒」閃爍液：Econofluor（Invitrogen）
8. 去離子蒸餾水（DDW）
9. 聚丙烯閃爍杯：3.5 mL
10. 微量離心管
11. 微量離心機
12. 冰浴
方法A：6 孔、35 mm 培養板上的細胞收集
1. 轉染后 24~72 h，用 D-PBSA 液洗滌細胞。
2. 將培養板置于冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton。
3. 將培養板-70℃ 冷凍 2 h。
4. 于 37℃ 下解凍培養板，然后將其置于冰上。
5. 將細胞裂解物移至微量離心管中，以大速度離心 5 min。
6. 收集上清液，65℃ 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質。
7. 大速度離心 3 min 后收集上清液（細胞裂解物），將上清液保存在-70℃。
方法 B：CAT 測定
8. 從每一樣品中取 5~150uL 細胞裂解物，移至一個 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，并且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150uL。
9. 設空白杯，加入 150uL 0.1mol/LTris 液，作為陰性對照。
10. 陽性對照：
（a）取 5 個閃爍杯，各加入 150uL 0.1mol/LTris。
（b）將 5uL 的 CAT 標準液加入到每個閃爍杯中，繪制 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標準曲線。
11. 在所有樣品杯（包括對照）中，加入 100uL 以下混合液：
（a）84uL 超純水
（b）10uL 0.1mol/LTris
（c）1uL 的氯霉素
（d）5uL（50nCi）的 14C-CoA
12. 擰緊杯蓋，于 37℃ 下孵育 2 h。
13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋。
14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分。
15. 室溫下孵育 2 h。
16. 在一個液閃計數儀上測定 30s 閃爍次數。
收起
注意事項
1. 在表達質粒擴增與制備一步，要特別注意其純度（不能含RNA和染色體DNA）以免影響轉化效率
2. 制備方法選用溶菌酶加Triton10，然后氯化艷梯度離心。
3. 一定要有對照組用CAT酶代替細胞提取液，來驗證反應及層析等過程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表達質粒驗證轉化及重組兩步的正確性。
4. 在制備細胞提取液中選用超聲波破碎法，離心前要注意檢查破碎程度。凍融法繁瑣有時破碎不*影響結果。
5. 4mmol/L乙酞輔酶A可每次取1.smg溶在500川水中，用前配制，配制的溶液可保存于一20℃，但不可超過十天。
展開
其他
成功地組裝表達質粒是該項檢測技術的關鍵之一,表達DNA質粒必須具有下列幾種元件:（1）供細胞復制的原核編碼順序和供啼選用的標記基因(抗菌素基因);（2）控制真核細胞轉錄的調控元件(增強子、啟動子);（3）控制轉錄后的一些信號,轉錄加工裁剪信號,加尾信號,供在哺乳動物表達中用;（4）未知待測基因順序可取代上述的轉錄調控順序;（5）標記基因(氯霉素乙酸轉移酶)。
參考：
1、《動物細胞培養：基礎技術指南（第五版）》；
2、《霉素乙酞轉移酶檢測(CATassay)基礎醫學與臨床》