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腫瘤細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)及保種
閱讀：913 發(fā)布時(shí)間：2019-5-10實(shí)驗(yàn)方法原理
腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置，是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。癌細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞界限清晰，對營養(yǎng)要求不高，在體外培養(yǎng)可無限制傳代而不凋亡。體外培養(yǎng)的細(xì)胞一旦建立細(xì)胞系就需要進(jìn)行一系列細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定。
腫瘤細(xì)胞可置于低溫下保存。-80℃下可保存細(xì)胞半年至一年, 液氮可保存細(xì)胞5—10 年, 甚至更長的時(shí)間。
實(shí)驗(yàn)材料 腫瘤細(xì)胞
試劑、試劑盒 液氮EDTA保種液
儀器、耗材 恒溫水浴鍋低溫離心機(jī)方瓶CO2培養(yǎng)箱-70度冰箱彎管顯微鏡離心管濾膜
實(shí)驗(yàn)步驟
一、細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)
將液氮或-80℃保存的腫瘤細(xì)胞于37℃ 水浴, 快速溶化, 用8.0ml 培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液, 于1500 轉(zhuǎn)/分, 離心3 分鐘。棄上清, 再吸取8.0ml 培養(yǎng)基質(zhì)混勻細(xì)胞沉淀, 再1500 轉(zhuǎn)/分, 離心3 分鐘, 棄上清, 細(xì)胞沉淀用1.0ml 培養(yǎng)基混勻, 備用。另取一個(gè)75cm2 方瓶, 加入14.0ml 培養(yǎng)基質(zhì), 將上述制備的含腫瘤細(xì)胞懸液(1.0ml)加入此方瓶中, 于37℃，5%CO2 孵育箱中培養(yǎng)。若此腫瘤細(xì)胞懸浮生長, 大約3－4 天細(xì)胞基質(zhì)會變黃, 5.0ml 細(xì)胞懸液可傳代一個(gè)方瓶培養(yǎng), 可用3－4 個(gè)方瓶培養(yǎng), 一個(gè)方瓶中呈對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞可達(dá)1-1.5x107 個(gè), 根據(jù)試驗(yàn)所需, 可決定傳代的次數(shù)。若此腫瘤細(xì)胞呈貼壁生長, 經(jīng)過3-4 天, 腫瘤細(xì)胞生長至80%-95% 單層時(shí), 棄上清, 用0.5mM 的EDTA(難消化的腫瘤細(xì)胞用0.25%胰酶1.0ml), 處理腫瘤細(xì)胞大約3-5 分鐘, 用倒置顯微鏡觀察，當(dāng)90% 的腫瘤細(xì)胞變圓時(shí), 即可用彎管吹打并將消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中, 于1500 轉(zhuǎn)/分下，離心3 分鐘, 棄上清, 加少許培養(yǎng)基混勻, 可傳代3 個(gè) 75cm2方瓶擴(kuò)大培養(yǎng)。
二、細(xì)胞凍存
將對數(shù)生長的腫瘤細(xì)胞用1 個(gè)75cm2方瓶按上述方法收集, 于1500 轉(zhuǎn)/分離心3 分鐘,棄上清, 用保種液(含10% DMSO 的小牛血清)3.0ml 混勻, 分別加入到2-3 只保種管中, 寫上腫瘤細(xì)胞名稱, 時(shí)間, 保種者姓名, 放-80℃保存, 次日將它們轉(zhuǎn)移到液氮中保存(注: -80℃下可保存細(xì)胞半年至一年, 液氮可保存細(xì)胞5-10 年, 甚至更長的時(shí)間)。以上所有物品均需經(jīng)過高溫滅菌( 121℃, 30 分鐘)，培養(yǎng)基質(zhì)則經(jīng)過過濾(0.22uM)除菌, 所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù), 避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
收起
注意事項(xiàng)
所有操作均必須遵守?zé)o菌操作技術(shù), 避免細(xì)菌、真菌、病原體、衣原體等污染。
其他
1.癌細(xì)胞經(jīng)常重疊生長，如果混有成纖維細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)在傳代時(shí)采用消化消除法及反復(fù)貼壁法加以清除。
2.在早期傳代時(shí)要適當(dāng)提高接種濃度。
3.對于增殖能力極低的細(xì)胞，應(yīng)放入飼養(yǎng)層培養(yǎng)，并加入一些促生長物質(zhì)，如胰島素，雌激素，EGF，氫化考的松，軟鐵蛋白等因子。