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滾環擴增（RCA）試劑盒操作方法
閱讀：6753 發布時間：2019-5-22滾環擴增（RCA）試劑盒操作方法
滾環擴增（rolling circle amplification，RCA）是近幾年發展起來的一種核酸恒溫擴增方法。以環狀 DNA 為模板，通過一個短的 DNA 引物（與部分環狀模板互補），在 phi29 DNA 聚合酶催化下將 dNTPs 轉變成單鏈 DNA，此單鏈 DNA 包含成百上千個重復的模板互補片段。這種方法不僅可以直接擴增 DNA 和 RNA，還可以實現對靶核酸的信號放大，靈敏度達到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應用價值和潛力。因其高靈敏度、高特異性和可操作性，RCA 技術在基礎研究、實際檢測、醫療診斷及納米材料等方面都有很好的應用，結合細胞原位檢測、單核苷酸多態性 SNPs， 蛋白質分析、免疫芯片和全基因組的擴增等研究都能發揮其巨大的優勢。
本試劑盒配備的 phi29 DNA 聚合酶具有鏈置換和連續合成特性，可連續合成長達 70kb 的 DNA 片段。另外，該酶具有 3’→5’外切酶校讀功能，合成的 DNA 片段保真性高。試劑盒配備的 Random Hexamers 為 6 堿基隨機引物可對目標分子進行指數放大（通常放大 10000 倍）。
滾環擴增（RCA）試劑盒操作方法RCA 的原理圖如下：
滾環擴增（RCA）試劑盒操作方法本產品具有下列特點：
即開即用，十分簡單方便，用戶不需要單獨準備各成分。配方經過精心優化，長模板可以達 70kb。
高保真酶，所得 DNA 突變率低
本試劑盒可以進行 50 次 20uL 體系的 RCA 實驗。
1. 純化帶有靶片段的環狀 DNA 或長度在 10kb 以上的線狀 DNA，將其準確定量并稀釋到 2pg/uL。注意：堿變性法提取的質粒 DNA 都有殘留的 RNA 污染，盡管電泳時看不見，但測 OD 時這些 RNA 會使得 DNA 濃度虛高。因此質粒 DNA 需要電泳時跟濃度已知的 DNA marker 比較來確定濃度。此方法誤差在 2 倍之內，但可以接受。
2. 在 PCR 塑料管中加入不超過 5 uL 純化好的模板 DNA，用量在 50pg 左右。如果體積不足 5uL，則用自備的超純水補齊。同時做一個不加模板 DNA 模板的陰性對照。
3. 加入等體積（2.5uL）變性液，輕柔吹打混勻。
4. 室溫放置 2 分鐘。
5. 加入 2.5uL RCA 溶液 A。此時樣品總體積為 10uL。
6. 在 10uL 樣品中，加入 10 uL 的 RCA 溶液 B，輕柔吹打混合均勻。
7. 加入 1 uL phi 29 DNA 聚合酶（10U/uL），輕柔吹打混合均勻。
8. 30℃保溫 24 小時。注意：反應時間不要短于 24 小時。使用 PCR 儀進行 30℃ 保溫并打開熱蓋保溫。如果采用 30℃水浴，在樣品管中加入 30-50uL 石蠟油以防水分蒸發，因為 30℃長時間的水浴也能使水分蒸發到管壁，從而改變反應體系中各成分的濃度、降低 RCA 反應效率。
9. 65℃保溫 10 分鐘使 phi29 DNA 聚合酶滅活。注：由于 phi29 DNA 聚合酶有 DNA
外切活性，所以將其滅活以免干擾后續反應。
10. 立即取 5uL RCA 反應液進行電泳檢測擴增效果，DNA 片段大小將在 10kb 以上， 可達 70kb。
11. 擴增的 DNA 可以用于后續試驗或電泳檢測。換一下
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