一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供動物樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。 - 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL陽性對照（濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備 - 用自選方法純化樣品的DNA，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
- 如果有N個樣品，則需要進行N+2個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的天凈沙核酸釋放劑試用裝，則登陸公司網站輸入產品名稱天凈沙核酸釋放劑或產品編號61202下載。
三、設置qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行） - 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液，濃度為10000拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標曲反應縮減成1個，其余不變。
- 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） | 2×qPCR MagicMix | 各10 μL | 10 μL | 各10 μL | 鹿源型成分染料法PCR 引物混合液 | 各2 μL | 2 μL | 各2 μL | 自備10×ROX (見注) | 各2 μL | 2 μL | 各2 μL | N+2個制備的DNA模板 | 各6 μL | 不加 | 不加 | 超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 | 第7步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。 - 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行qPCR（具體PCR參數可以根據qPCR儀器的不同而自行優化）。
四、qPCR反應參數 過程 | 溫度 | 時間 | 預變性 | 95℃ | 3 min | PCR反應 （40個循環） | 95℃ | 0.5 min | 60℃ | 1 min（采集FAM通道的熒光信號） |
五、數據處理 - 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
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