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細胞表面標記的檢測技術活細胞免疫熒光技術－流式細胞儀標本的制備
閱讀：322 發布時間：2019-9-16實驗方法原理 活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。
實驗材料 抗體血清
試劑、試劑盒 RPMI1640DPBS洗滌液固定液
儀器、耗材 玻璃管塑料管離心機顯微鏡
實驗步驟
1. 制備活性高的細胞懸液（培養細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）
2. 用10 ％FCS RPMI1640調整細胞濃度為5×106～1×107 /ml
3. 取40 μl細胞懸液加入預先有特異性McAb（5～50 μl）的小玻璃管或塑料離心管，再加50 μl 1∶20（用DPBS稀釋）滅活正常兔血清，4 ℃ 30 min
4. 用洗滌液洗滌2 次，每次加洗滌液2 ml左右，1000 rpm×5 min
5. 棄上清，加入50 μl工作濃度的羊抗鼠（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖，4 ℃ 30 min
6. 用洗滌液洗滌2 次，每次加液2 ml左右，1000 rpm×5 min
7. 加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入1 ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，視細胞濃度加入100～500 μl固定液）
8. FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察（標本在試管中可保存5～7 天）
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注意事項
1. 整個操作在4 ℃下進行，洗滌液中加有比常規防腐劑量高10倍的NaN3，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發生交聯、脫落。
2. 洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現假陰性。
3. 加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
4. 細胞活性要好，否則易發生非特異性熒光染色。
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其他
一、附錄
1. DPBS （×10， 貯存液）
NaCl 80 g，KCl 2 g，蒸餾水加至1000 ml，Na2HPO4 11.5 g，臨用時用蒸餾水1∶10稀釋，KH2PO4 2 g
2. 洗滌液
DPBS 900 ml，FCS 50 ml（終濃度5 ％），4 ％ NaN3 50 ml（終濃度0.2 ％）
3. 固定液
DPBS 1000 ml，葡萄糖 20 g（終濃度2 ％），甲醛 10 ml，NaN3 0.2 g （終濃度0.02 ％）