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一、實時熒光定量PCR原理

 

（一）定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 。

 

（二）實時原理

 

1、常規(guī)PCR技術：

 

對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。

 

2、實時定量PCR技術：

 

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析

 

3、如何對起始模板定量？

 

通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析.

 

4、幾個概念：

 

（1）擴增曲線 ：

 

（2） 熒光閾值：

 

（3）Ct值：

 

CT值的重現(xiàn)性：

 

5、定量原理：

 

理想的PCR反應： X=X0*2n

 

非理想的PCR反應： X=X0 (1+Ex)n

 

n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)

 

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

 

X0：初始模板量

 

Ex：擴增效率

 

5、標準曲線

 

6、定量

 

1）確定未知樣品的 C(t)值

 

2）通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量（2） 熒光閾值：

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

（3）Ct值：

 

 

 

CT值的重現(xiàn)性：

 

 

 

5、定量原理：

 

理想的PCR反應： X=X0*2n

 

非理想的PCR反應： X=X0 (1+Ex)n

n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)

X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量

X0：初始模板量

Ex：擴增效率

 

5、標準曲線

 

 

 

6、定量

 

1）確定未知樣品的 C(t)值

 

2）通過標準曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量