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原代小鼠心肌成纖維細胞分離和培養方法
閱讀：783 發布時間：2020-2-12 小鼠心肌成纖維細胞的組織來源于實驗動物的正常心臟組織，心臟是脊椎動物身體中重要的一個器官，主要功能是提供壓力，把血液運行至身體各個部分。心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應氧和各種營養物質，并帶走代謝的終產物（如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等），使細胞維持正常的代謝和功能。
心臟中，心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數的60%-70%，是心臟中非心肌細胞的主要組成部分，廣泛存在于心臟組織中，包圍心肌細胞，連接心肌細胞間質，與缺血性心臟病、炎癥、肥大、梗死等病理狀態密切相關。細胞生長方式以長梭狀細胞，貼壁培養。
小鼠心肌成纖維細胞的方法有很多，賽百慷提供的心肌成纖維細胞分離方法有兩種，一種是貼塊法，一種是消化法，這兩種方法都可以用于分離和培養原代細胞。
實驗器械：
1.培養皿
2.T-25細胞培養瓶
3.100目不銹鋼網篩
4.200目不銹鋼網篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管（15ml、50ml）
實驗分離和培養步驟：
1. 小鼠頸椎脫臼處死后，剃除腹胸部的被毛，放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。
2. 取出小鼠，在無菌環境下打開胸腔，取出心臟組織，注入盛有無菌1×PBS的培養皿中，洗凈組織表面的血液。
3. 將清洗干凈的心臟組織轉入裝有75%酒精的培養皿中浸泡15s以殺死大多數的心臟被膜細胞，浸泡完成后立即轉入裝有無菌1×PBS的培養皿中震蕩清洗。
4. 清洗完成后，用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織，僅保留心室部分，再次用1×PBS清洗去除心室內的血液。
5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊，之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進行后續操作。
A.貼塊法
6. 將清洗好的碎塊轉入另一培養皿中，用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織，室溫消化3-5min。
7. 消化完成后，添加數毫升FBS終止消化，之后吸棄液體，加PBS清洗組織塊1伺次后，用200ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養瓶的培養面上，之后將培養瓶放置于37℃二氧化碳培養箱中，靜置2-4h。
8. 待組織處于略微脫水的狀態時，小心添加2ml*培養基，添加時注意盡量不要將組織塊沖起，要使培養基接觸所有的組織塊。
9. 之后放入培養箱中繼續培養，一般2-4天后成纖維細胞會從組織塊周圍爬出，待爬出的細胞有較多數量時，可將細胞消化下來，去除組織塊，轉入另一培養瓶中培養。
B.消化法
6. 將清洗好的碎塊轉入另一離心管中，加入混合消化液（0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶）37℃水浴消化8min后，吸取上層混懸液棄去。
7. 余下組織加入混合消化液10ml，37℃水浴震蕩消化10min；吸取上層懸液至另一離心管中，加入適量FBS終止反應；剩余沉淀物再加消化液消化3-5次，直至組織塊*消化。
8. 按1∶1加入含血清的培養基，中止酶反應，懸液過150目網篩去除較大的組織塊。
9. 收集全部中止后的消化液于離心管中，300g，離心10 min，棄去上清，加入培養液重懸細胞后計活細胞數。
10. 調整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養瓶中，每瓶添加2ml細胞懸液。
11. 培養瓶放置于37℃，5% CO2培養箱中靜置40min后，吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞，再添加5ml*培養基繼續培養。