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WB半定量內參有丟失，你卻一直不知道？
閱讀：699 發布時間：2020-9-1蛋白研究中，要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，選方法是Western Blot，WB可對蛋白進行定性和半定量分析。我們天天都在做，但是半定量我們真的做對了嗎？我們先來看看以下幾個概念。
半定量
所謂的半定量，是將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果，是一個比值差異的統計學分析。
內部參照
內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白（Housekeeping Proteins），它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。
總蛋白提取
從培養的細胞/組織中提取全蛋白，也叫總蛋白，是蛋白質分析和純化常用的方法之一。理想的蛋白提取案應該能夠從樣品中提取所有蛋白質而不產生偏差。
然而，由于樣品之間，蛋白質間之間都具有很大的差異，使得總蛋白提取時同時釋放和溶解所有蛋白，變得極為困難。例如：蛋白質與膜整合或與其他蛋白質或核酸形成復合體時，都將大阻礙蛋白提取的效率。因此，與體內情況相比，提取的蛋白質可能或多或少的失真。因此，內參的相對量也可能被改變。
讀而思
duersi
我們使用RIPA裂解液提取蛋白后通常產生RIPA可溶性組分和RIPA不可溶性組分，RIPA不可溶組分通常會被丟棄掉，扔掉的不可溶組分中有沒有內參呢？我們的目的蛋白又有哪些變化呢？我們解析了如下文獻：
1
Kevin A. Janes，2017，Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
實驗方法：
1.HT-29人結腸腺癌細胞使用RIPA裂解液裂解，RIPA不可溶組分使用Laemmli 樣品緩沖液煮沸上樣。
2.WB檢測20種不同的抗體。
實驗結果：
1. RIPA裂解液有效地溶解了許多細胞質蛋白和信號蛋白，如 GAPDH，Hsp90，IκBα等。
2.但Actin，tubulin，Lamin A和KRT5等蛋白在RIPA不可溶組分中大量丟失。
3. 值得注意的是：RIPA不可溶性組分不僅限于細胞骨架蛋白，轉錄因子GATA2和細胞粘附蛋白β-catenin也有丟失。
4.而和DNA緊密結合的蛋白質H3則*存在于RIPA不可溶組分中。
2
實驗方法：
1.野生型和CBL三重缺陷型原代小鼠乳腺上皮細胞分別使用RIPA提取蛋白，離心后的RIPA不可溶組分用SDS樣品buffer直接溶解上樣。
2.WB檢測EGFR，HSP90，c-Src，Tubuin，pY-1068EGFR，pY-416c-Src。
實驗結果：
1.Tubulin在RIPA不可溶組分中大量丟失。
2.有些蛋白（pY-1068EGFR）不存在于RIPA不可溶組分中，而有些蛋白（pY-416c-Src）則出現嚴重丟失，甚至不可溶性組分中信號比可溶性組分更強。
3.同一種蛋白（EGFR，HSP90，c-Src）在不同樣品中丟失的情況并不相同。
同樣的問題在SU YEON LEE和Eugene Khandros等人的研究中也出現了，Tubulin和Actin等常用內參在RIPA不可溶組分中大量丟失，如下圖：
SU YEON LEE，2010，
DOI: 10.3892/or_00000830
Eugene Khandros，2012，DOI1 0.1182/blood-2011-12-397729
總結
使用RIPA提取的總蛋白
1.并非是真正意義上的總蛋白，相當一部分蛋白丟失在棄去的不可溶組分中。
2.很多常用的內參，如Actin，tubulin，LaminA，H3等均在RIPA不可溶組分中被丟失。
3.目標蛋白可能會在RIPA不可溶組分中被丟失，也可能不被丟失，具有不可預見性，非選擇性。
4.同種蛋白在不同樣品中丟失的情況并不相同，蛋白丟失并不成比例。
5.利用目的蛋白和內參比值做校正會出現偏差，不適合WB目的蛋白的半定量分析。
樣品制備時出現蛋白丟失的問題，真的是我們這么多年一直忽視的問題，特別是內參會丟失，目的蛋白可能丟，也可能不丟，這樣的半定量結果是有偏差，不嚴謹的，所以要給與重視！
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