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多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

PPO（EC1.10.3.1）主要存在于動物、植物、微生物和培養細胞中，是一種含銅的氧化酶，

能使一元酚和二元酚氧化產生醌，從而引起褐化，與果蔬加工、茶葉品質和組培等密切相關。

測定原理：

PPO 能夠催化鄰苯二酚產生醌，后者在 525nm有特征光吸收。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔

板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：20mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：5mL×1 瓶，4℃保存；

試劑三：10mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10

4 個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超

聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃

離心10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加

入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）或果汁樣本的處理：

按照血清（漿）或果汁體積（mL）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議取0.1mL血清

（漿）或果汁加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至525nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定（在 EP 管中依次加入下列試劑）

試劑名稱（μL） 測定管 對照管

試劑一 200 200

試劑二 50 50

樣本 50

煮沸的樣本 50

37℃(哺乳動物)或 25℃（其它物種）中準確水浴10min 后迅速放入冰浴中冷卻

試劑三 100 100

充分混勻，10000g，常溫離心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm

處檢測測定管和對照管吸光度，計算 ΔA=A測定-A對照。

注意：每個測定管需要設一個對照管。可以在不同對照管中加入不同樣品的粗酶液，然后集

中進行 1min 沸水浴處理。

PPO 活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01

為一個酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液

2、組織、細菌或細胞 PPO 活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力

單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個酶活力單位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =80×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.01為一個

酶活力單位。

PPO（U/10

4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =0.16×ΔA

V 反總：反應體系總體積，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL；V 樣：加入樣

本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白質

濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）或果汁PPO活性

單位的定義：每分鐘每mL血清（漿）或果汁在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005

為一個酶活力單位。

PPO（U/mL）=ΔA×V 反總÷(V 液× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷V 液

2、組織、細菌或細胞 PPO 活性

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每分鐘每mg組織蛋白在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活

力單位。

PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =160×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位定義：每分鐘每g組織在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個酶活力單

位。

PPO（U/g 鮮重）=ΔA×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =160×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每分鐘每1萬個細菌或細胞在每mL反應體系中使525nm處吸光值變化0.005為一個

酶活力單位。

PPO（U/10

4cell）=ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =0.32×ΔA

V 反總：反應體系總體積，0.4mL；V 液：加入血清（漿）或果汁體積，0.1mL； V 樣：加入

樣本體積，0.05mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，10 min；Cpr：樣本蛋白

質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬