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多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術要點
閱讀：403 發布時間：2022-4-22多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術要點
分光光度法50管/24樣
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
多聚半乳糖醛酸酶（EC3.2.1.15）是一種細胞壁結合蛋白，可以催化果膠分子中α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，參與果膠的降解，使細胞壁結構解體，導致果實軟化，與果實成熟、葉和花的脫落、病原物防御，細胞伸展發育以及木質化有關，在植物抗病性和食品貯藏保鮮領域具有較高的研究價值。
測定原理：
多聚半乳糖醛酸酶水解果膠酸生成半乳糖醛酸，具有還原性醛基，與DNS試劑反應生成紅棕色物質，在540nm有特征吸收峰，測定540nm處吸光值變化可計算得多聚半乳糖醛酸酶活性。
自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 mL玻璃比色皿、恒溫水浴鍋。
試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體25mL×1瓶，4℃避光保存。
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術要點酶液提取：
1．組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。16000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2．細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后16000g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測。
3．培養液：直接檢測。
測定操作表：
對照管 | 測定管 | |
樣本（μL） | 100 | |
煮沸樣本（μL） | 100 | |
試劑一（μL） | 400 | |
蒸餾水（μL） | 400 | |
40℃水浴30min | ||
試劑二（μL） | 500 | 500 |
沸水浴5min，冰浴或自來水冷卻，蒸餾水調零，1mL玻璃比色皿測定540nm處吸光值A，△A=A測定管-A對照管。每個測定管設一個對照管。 | ||
酶活性計算公式：
標準曲線：y = 3.9642x - 0.008；R2 = 0.9996；x為標準品濃度，mg/mL；y為吸光值。
1．按照蛋白濃度計算
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術要點酶活性定義：
在40℃，pH6.0條件下，每毫克蛋白每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/mg prot）= (ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×Cpr）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷Cpr
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每克樣本每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/g 鮮重）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷W
3．按液體體積計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每毫升培養液每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/mL）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷V樣÷T=2.523×(ΔA+0.008)
4. 按細胞數量計算
酶活性定義：在40℃，pH6.0條件下，每104個細胞每小時分解果膠酸產生1mg半乳糖醛酸為一個酶活力單位。
PG活性（mg/h/104cell）=(ΔA+0.008) ÷3.9642×V反總÷（V樣×細胞數量÷V樣總）÷T
= 2.523×(ΔA+0.008)÷細胞數量
V反總：反應總體積，0.5mL；V樣：反應中樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，0.5h
注意事項：
煮沸樣本建議將樣本在沸水中煮沸10分鐘，以將酶*滅活。
多聚半乳糖醛酸酶（PG）試劑盒技術要點