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果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)試劑盒說明書
閱讀：496 發(fā)布時間：2023-4-10果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP)試劑盒說明書
微量法100管/96樣
注 意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義：
果糖-1,6二磷酸酶又稱果糖1,6二磷酸酯酶，催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機磷，在糖的異生代謝和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。
測定原理：
FBP催化1,6二磷酸果糖和水生成6磷酸果糖和無機磷，在反應體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計算FBP活性。
需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制：
提取液一：液體100mL×1瓶，4℃保存。
提取液二：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，-20℃保存；臨用前加入20mL試劑四充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑二：液體7.2μL×1支，4℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；臨用前加入1mL蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存；
試劑四：液體25mL×1瓶， 4℃保存；
樣本的前處理：
①總FBP酶提取：建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定。
②胞漿和葉綠體FBP酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液一），冰浴勻漿后于4℃，200g離心5min，棄沉淀，取上清在4℃，8000g離心10min，取上清用于測定胞漿FBP酶活性，取沉淀加1mL提取液二，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇7s，總時間1min），然后4℃，8000g離心10min，取上清測定葉綠體中FBP酶活性。
建議測定總FBP酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測定胞漿和葉綠體中的FBP，則按照步驟②提取粗酶液。
測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一、二、三37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10分鐘。
3、 加樣表：
試劑名稱（μL） | 測定管 |
樣本 | 20 |
試劑二 | 10 |
試劑三 | 10 |
試劑一 | 160 |
將上述試劑按順序加入微量石英比色皿或96孔板中，立即混勻，加入最后一個試劑的同時開始計時，在340 nm波長下記錄反應1min后吸光度A1和反應6min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。
FBP活性計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。
b. 用96孔板測定的計算公式如下
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
FBP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位的定義：每g組織每分鐘生成1 nmol的NADPH定義為一個酶活力單位。
FBP（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=643×ΔA÷W
V反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。