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細胞屬性：

方法簡介

公司實驗室分離的小鼠卵泡膜采用先機械分離后膠原酶消化結合Percoll密度梯度離心法、并通過專用培養基培養篩選制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠卵泡膜經3β-HSD免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠卵泡膜細胞分離自卵巢組織；卵巢是雌性動物的生殖器官，卵巢的功能是產生卵以及類固醇激素。卵巢的位置與睪丸相同，僅左側發育（右側已退化），呈葡萄狀，均為處于不同發育時期的卵泡，卵泡呈黃色，卵巢表面密布血管。卵巢的大小與年齡和產卵期有關。大多數脊椎動物有兩個卵巢，但是部分魚類的兩個卵巢融合為單個結構，而所有鳥類只有左側卵巢有機能。卵巢是位于子宮兩側的一對卵圓形的生殖器官，它的外表有一層上皮組織，其下方有薄層的結締組織。卵巢的內部結構可分為皮質和髓質。皮質位于卵巢的周圍部分，主要由卵泡和結締組織構成；髓質位于中央，由疏松結締組織構成，其中有許多血管、淋巴管和。哺乳動物的卵巢內卵泡的發育需要相關激素的調節才能完成，垂體（卵泡刺激素和黃體生成素）使原始卵泡開始發育，其過程中還產生大量的雌激素。雌激素是卵巢的顆粒細胞和卵泡膜細胞在垂體的作用下協同合成的，卵泡膜細胞合成的雄激素透過基膜進入顆粒細胞，并轉變為雌激素。因此，卵泡膜細胞在生殖內分泌調節中占有關鍵的位置，了解其在病理及生理中的作用，對于與性激素有關的婦產科疾病（如多囊卵巢綜合癥、卵巢癌等）的研究有著重要意義。在哺乳動物卵泡生長發育的過程中，卵母細胞由不斷增加的顆粒細胞層包裹。卵巢組織中的膜細胞作為卵泡的外層細胞可以維持卵泡結構的完整性，參與構成卵母細胞和顆粒細胞發育的微環境且為類固醇激素的生成提供底物。在哺乳動物中調節膜細胞類固醇激素生成的機制已見相關報道，但是有關卵泡膜細胞的聚集、生長和分化的研究尚不深入。

培養信息：

培養基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 成纖維細胞樣

傳代特性 可傳3代左右

消化液 0.25%

培養條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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