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細胞屬性：

?方法簡介

公司實驗室分離的小鼠羊膜胚胎采用-膠原酶聯合消化法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。

質量檢測

公司實驗室分離的小鼠羊膜胚胎經PCK免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

細胞簡介：

小鼠胚胎羊膜細胞分離自羊膜組織；羊膜為單層上皮細胞互相連接構成的薄膜。單層上皮細胞具有分泌羊水的作用。隨著胚胎的生長發育，羊膜與絨毛密切緊貼，形成胎膜。胎膜隨著羊膜腔逐漸擴大而呈半透明的薄膜，無血管，富有韌性（胎膜也就是羊膜腔的囊壁）。羊膜腔內充滿的液體為羊水。羊膜僅覆蓋在胎盤的兒體面，并不深入胎盤組織中，隨著妊娠的進展羊膜腔逐漸擴大，占據整個子宮腔，羊膜是胎膜內一層，是一層半透明的薄膜，與覆蓋在胎盤、臍帶的羊膜層相連接。羊膜是胎盤的內層，與人眼結膜組織結構相似，含有眼表上皮細胞，包括結膜細胞和角膜上皮細胞生長所需要的物質，其光滑，無血管、及淋巴，具有一定的彈性，厚0.02~0.5mm，在電鏡下，其分為五層：上皮層、基底膜、致密層、纖維母細胞層和海綿層，羊膜基底膜和羊膜基質層含有大量不同的膠元，主要為i、iii、iv、v、vii型膠原和纖維粘連蛋白、層粘連蛋白等成份，正是這些成份使羊膜可以充當“移植的基底膜"而發揮一種新的健康合適的基質。羊膜細胞主要由羊膜上皮細胞和羊膜間充質細胞組成，均具有多分化潛能，可轉化為元，且還有合成、釋放生物活性物質和營養因子的功能。

培養信息：

包被條件 鼠尾膠原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培養基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態 梭形、多角形

傳代特性 可傳1-2代

消化液 0.25%

培養條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

細胞培養方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養箱繼續消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養基重懸后加入培養瓶或皿中，T25培養瓶加6-8ml培養基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養基吹勻，將細胞懸液加入培養瓶中，補加適量培養基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入培養基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

操作步驟：

1.將無菌的蓋玻片置于細胞培養皿中，將細胞懸液接種于培養皿中進行細胞爬片，待細胞長至80%時取出爬片。

2. 用PBS浸洗爬片3次，4%的多聚甲醛固定爬片15min，再次用PBS浸洗玻片3次，每次3min。

3. 0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫孵育爬片20min，使細胞通透。

4. 3% H2O2滴加爬片上以阻斷內源性過氧化物酶，室溫孵育15min（一般用甲醇或蒸餾水稀釋30%過氧化氫），PBS沖洗3次，每次3min。

5. 封閉血清室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次3min。

6. 細胞特異性一抗孵育：按照抗體說明書稀釋比例稀釋好一抗，滴加在爬片上，于4°C濕盒中孵育一夜，PBS沖洗3次，每次3min。

7. 二抗孵育：選與一抗對應的二抗，按比例稀釋后滴加在爬片上，37°C濕盒中孵育30min，PBS沖洗3次，每次3min。

8. 將爬片周圍水漬吸干，爬片上滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，當出現棕黃色或棕褐色的陽性信號時用蒸餾水沖洗終止顯色。

9. 復染：用Harris蘇木素復染30s~1min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用蒸餾水（或PBS）水洗返藍。

10. 封片：將中性樹膠滴在爬片一側，再用蓋玻片蓋上，先放平蓋玻片一側再輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好的爬片平放置于通風廚中晾干。

11. 鏡檢觀察。

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