發光分光光度計采用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，部分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式：A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc
式中：A 為吸光度；
I0：為入射的單色光強度；
I：為透射的單色光強度；
T：為物質的透射率；
k：為摩爾吸收系數；
L：為被分析物質的光程，即比色皿的邊長；
c：為物質的濃度；
操作方法：
1、接通電源，打開儀器開關，掀開樣品室暗箱蓋，預熱10分鐘。
2、將靈敏度開關調至“1”檔。
3、根據所需波長轉動波長選擇鈕。
4、將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內，使空白管對準光路。
5、在暗箱蓋開啟狀態下調節零點調節器，使讀數盤指針指向t=0處。
6、蓋上暗箱蓋，調節“100”調節器，使空白管的t=100，指針穩定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。
7、比色完畢，關上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。
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