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注意微生物污染

6個月

1. 離心機
2. 移液器
3. 冰箱
4. 冰盒

1.PBS緩沖液 2.HBSS

1. 離心管
2. 吸頭
3. 一次性手套

1. 注意無菌操作，盡量避免污染。
2. DNA不應含有蛋白和酚。
3. 休克處理某些細胞系會使轉染效率大大提高，但應注意甘油暴露過久易導致細胞死亡。
4. 轉染12～24h后，可以加入終濃度為10mmol/L的丁酸鈉溶液，可以提高病毒滴度。
5. BBS Solution的pH值直接關系到轉染效率，盡量避免長時間暴露在空氣中，以免被空氣中的二氧化碳酸化。
6. 轉染時，把DNA-氯化鈣溶液加入到BBS溶液中，不要把BBS溶液加入到DNA-氯化鈣溶液中。
7. 高純度的質粒是獲得高轉染效率的必要條件，要確保A260/A280大于1.8，并且電泳檢測抽提到的質粒90%以上都是超螺旋。
8. 在用磷酸鈣法轉染細胞時應使用濃度不高于5%的二氧化碳，二氧化碳的濃度為3%左右。
9. 轉染時由于質粒不同、細胞不同，的質粒用量需自行摸索。

貼壁細胞轉染：
1. 在轉染前24h用消化培養細胞，取適量對數期細胞轉移至新的培養器皿中，待細胞密度大70～80%滿時即可進行轉染。后續操作步驟均按6孔板計算，如果轉染器皿不同，請按比例自行調節用量。
2. 在加入DNA之前2～4h，加入2ml不含抗生素的培養液，置于37℃ 5% CO2培養箱培養。
3. 取DNA(體積不宜超過20μl)加入100μl Calcium chloride solution，混勻，即為DNA-CaCl2溶液。
4. 取BBS solution 100μl，用移液器一邊吹打BBS solution，一邊逐滴加入DNA-CaCl2溶液(操作緩慢，一般在1～2min)。
5. 室溫靜置20～30min，即為DNA-CaCl2-BBS溶液，此時可能出現極其微小顆粒沉淀。
6. 取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物質均勻加入到6孔板細胞中，輕輕晃動混勻。
7. 置于37℃ 5% CO2培養箱培養。
8. 去除培養液，用PBS清洗細胞2次，加入2ml培養液繼續培養，一般24h后可見轉染細胞的表達。

懸浮細胞轉染：
1. 低速離心收集懸浮細胞，用PBS洗滌1次。
2. 取DNA(體積不宜超過20μl)加Calcium chloride solution，混勻，即為DNA-CaCl2溶液。
3. 取BBS solution，用移液器一邊吹打BBS solution，一邊逐滴加入DNA-CaCl2溶液。
4. 室溫靜置，即為DNA-CaCl2-BBS溶液，此時可能出現極其微小顆粒沉淀。
5. 每106個細胞沉淀用100μl DNA-CaCl2-BBS溶液重新懸浮室溫放置。
6. 6孔板每孔加入2ml不含抗生素的培養基，取DNA-CaCl2-BBS溶液底部物質均勻加入到6孔板中，輕輕晃動混勻。
7. 置于37℃ 5% CO2培養箱培養，去除培養液，用PBS清洗細胞2次，加入2ml培養液繼續培養，一般24h后可見轉染細胞的表達。