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單克隆分離的方法及具體介紹
閱讀：1469 發布時間：2022-5-6
單克隆分離是建立穩定細胞系的重要環節，因而在現代生物技術和醫藥研發領域中應用廣泛，構建穩定細胞系的常用方法有質粒轉染法和病毒侵染法，兩種方法都需要借助抗生素篩選，通過單細胞克隆分離獲得穩定、遺傳特性一致的細胞群。
通過單細胞克隆分離和抗生素篩選，獲得表達效率高、整合穩定的細胞群，最終構建成穩定細胞系；而病毒侵染法則是通過將攜帶目的片段的病毒，常用的如慢病毒，轉導入細胞，再通過單細胞克隆和抗生素篩選，獲得穩定細胞系。
目前常規的單克隆分離技術主要包括有限稀釋法、克隆環法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細胞懸液連續梯度稀釋，使細胞培養板的一個孔中僅有1個細胞，再經過兩周左右時間增殖，形成細胞群，再經過驗證獲得穩定克隆；克隆環法是通過在10-15cm的細胞培養皿中，將細胞接種低密度，使分散的單個細胞各自增殖成細胞群，用克隆環方式與周圍的細胞隔離開，通過胰酶消化，轉到新的孔板中繼續培養擴增，并檢測驗證而獲得穩定克隆；顯微操作法是借助顯微鏡，在放大的視野下挑取單細胞，再轉至培養孔中，逐漸擴增獲得單克隆。
哺乳動物細胞通過分離、稀釋接種，培養在適宜于單細胞生長的培養液中，形成細胞克隆，運用這項技術可以制作細胞成活曲線，即在接種相同數量細胞的培養瓶中，加入不同濃度的化學藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對細胞的聽見害程度，由此可以在哺乳類細胞中進行誘變試驗及分離突變細胞。
方法：
a、在培養皿中制備飼養細胞(小鼠腹腔細胞)單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養液混勻，配成1%瓊脂糖培養液，45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養液，加入1%瓊脂糖培養液3ml，室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養液1ml混勻，鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養7-14天，克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養細胞的24孔板，擴大培養。
f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續克隆化，或擴大培養、凍存。