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高分辨SID-EMR Orbitrap儀器研制及大蛋白復合物結構測定
閱讀：804 發布時間：2019-3-9近日俄亥俄州立大學化學和生物化學系的VickiH. Wysocki教授課題組在AC上發表了一篇文章，題目為Surface-InducedDissociation of Noncovalent Protein Complexes in an Extended Mass RangeOrbitrap Mass Spectrometer。
獲取蛋白質復合物的四級結構信息，對于理解其生物功能來說至關重要。與傳統的CID/HCD通過多次碰撞沉積能量以實現解離相比，表面誘導解離(Surface induceddissociation，SID)是通過使復合物離子撞擊一個具有化學惰性、剛性的表面，經過單次高能撞擊后，產生相比于CID和HCD技術電荷更均勻分布的蛋白亞基，從而提供化學計量比和互作網絡等信息。此外，相比于CID常常導致小分子配體丟失，SID可以產生保留小分子配體的復合物亞基。
目前，SID技術在蛋白復合物方面的工作主要是在飛行時間質譜(TOF MS)上完成，但隨著蛋白復合物的分子量越來越大，結構解析深度越來越深入，對質譜儀器的分辨率也提出了更高的要求。每一種類型的質量分析器(TOF、FTICR或者Orbitrap)都有它們的優劣勢，而儀器的選擇主要依賴于待解決的問題本質。為此，Vicki H. Wysocki課題組與賽默飛公司Alexander A. Makarov博士合作，將SID解離源裝配到Exactive Plus Extended Mass Range(EMR)Orbitrap儀器上(如圖2)。這套SID即可用來傳輸離子又可用來進行SID。值得一提的是，SID裝置并未影響離子進入HCD池和一級質譜分析。
隨后，作者利用該儀器對Streptavidin和L-GlutamateDehydrogenase蛋白復合物進行了質譜分析。其中，前者是具有D2對稱性的同源四聚體，后者是具有D3對稱性的同源六聚體。圖3為Streptavidin的一級譜及其SID譜圖。先前的文獻表明，通過CID主要產生的是streptavidin復合物的去折疊單聚體和三聚體，但這一結果顯然不能支持streptavidin是由同源二聚體組成的結構。而11+的母體streptavidin復合物經過SID會解離成兩個二聚體，分別為5+和6+，證明SID更能反映他們真實的拓撲結構(圖3a-c)。值得一提的是，之前對于譜圖中出現的3+單聚體和6+同源二聚體，由于TOF MS分辨率不高所以要依靠IMS才能進行分辨3，但現在EMR Orbitrap在高分辨率模式(R=140,000 at m/z 200)下就可直接對它們二者進行分辨(圖3d)，甚至鹽加和離子或者N末端Met修飾與否都可以在高分辨譜圖中*獲得(圖3e)。
a)Streptavidin四聚體拓撲結構(PDB ID：1SWB)，b)Streptavidin四聚體一級質譜圖，c)11+價態Streptavidin四聚體的SID譜圖(45 V，495 eV)，d)高分辨率模式下3+價態Streptavidin單聚體和6+價態的二聚體，e)3+價態單聚體和6+價態二聚體的N末端蛋氨酸修飾和Na離子加和譜圖。
此外，作者還考察了L-Glutamate Dehydrogenase同源六聚體的拓撲結構。HCD結果表明，該六聚體很難在氣相中發生解離，需要較高HCD能量和高電荷態，常常導致先失去一個去折疊單體，無法真實反映亞基組成。而通過SID可以獲得比較穩定的三聚體信號，反映出L-GlutamateDehydrogenase同源六聚體的拓撲結構主要為三聚體-三聚體界面，在低能量下主要斷裂較弱的三聚體界面(圖4a)，當能量逐漸升高單體會從三聚體亞基中解離出來(圖4b)。
綜上所述，相比于SID-TOF MS儀器，具有更高質譜分辨率的SID–EMR Orbitrap儀器后續將為大蛋白復合物提供更豐富的四級結構信息。此外，Vicki H. Wysocki課題組先前還報道了將SID裝載到FTICR-MS儀器，在SID譜圖中可對霍亂毒素(Cholera toxin B，CTB)多種亞基進行同位素分辨(R=210,000 at m/z 5803.7)，例如8+四聚體、6+三聚體、4+二聚體和2+單聚體4，感興趣的學者們可進一步了解。得益于Orbitrap和FTICR的超高質量分辨率，相信SID源將在蛋白-蛋白、蛋白-金屬離子、蛋白-小分子配體復合物體系中發揮越來越重要的作用。