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人血漿中緩激肽的SPE LC-MS/MS定量檢測方法開發
閱讀：823 發布時間：2020-5-13緩激肽是一種含有9種氨基酸的生理和藥理活性肽，由蛋白質的激肽基團衍生而來（圖1）。激肽是可以促使血管舒張、血管通透性增強、一氧化氮釋放和花生四烯酸流動的效應因子。它是血壓、腎功能和心臟功能的重要調節因子，還參與炎癥反應1 。緩激肽可引起血管擴張，從而導致血壓降低。因此，對這種激素肽的變化進行高靈敏度、高選擇性和高準確度地定量，并將其作為疾病進展或藥物治療的評估指標，將會極為有利。盡管以往都是通過配體結合試驗（LBAs）對生物制劑進行定量分析，但在過去幾年中利用LC-MS/MS分析大分子已成為一種趨勢。這在某種程度上是因為LBAs產生顯著的交叉反應問題并且缺乏標準化。沃特世液質LC-MS/MS具有多種優勢，例如開發時間更短、準確度和精度更高、可重復進樣，并且容易區分相似度很高的類似物、代謝物或內源性干擾物。常見的肽通常難以通過LC-MS/MS進行分析，這是因為其不易離子化以及不易產生理想的碎片離子而導致MS靈敏度較低，從而使得 LC和樣品制備方法開發非常困難。由于緩激肽在血漿中的濃度低至pg/ mL水平且代謝速度快，在采血和樣品制備過程中還可通過蛋白水解人為生成，因此對其進行準確定量相當困難。
本研究采用了專門設計的血液收集技術以防止體外緩激肽的形成，并且利用混合型固相萃取（SPE）和高效實心核顆粒色譜柱，大限度降低并消除基質干擾的同時提高定量分析的靈敏度。
在m/z 531和m/z 354觀察到緩激肽的2+和3+母離子。緩激肽（圖A）和IS（圖B）的3+母離子的典型MS/MS譜圖如圖3所示。在方法開發過程中，記錄了一些不同的多電荷母離子和碎片離子。終使用了緩激肽和IS的3+母離子，因為它們在基質中強度高且選擇性佳。選擇m/z 419.18 y31+的碎片離子作為緩激肽定量分析的主要碎片離子。選取3+母離子和m/z 408.18 b41+碎片離子用于確證。對于IS，選擇了m/z 344.94的3+母離子和m/z 386.03 b72+碎片離子。MS條件如圖2 所示。盡管許多肽可以生成小于m/z 200的較強碎片離子，但在提取樣品中這些離子（通常為亞胺離子）由于缺乏特異性，會導致高背景噪音。在此檢測中，采用m/z值大于其母離子的高特異性b或y碎片離子顯著提高了特異性，便于使用更為簡單的LC和SPE方法。
結論：本研究開發了一種用于提取人血漿中緩激肽的混合模式 SPE提取方法。μElution SPE提取板消除了蒸發操作需求，并且利用非特異性結合和樣品濃縮而大大降低了損失的可能性。通過一種快速、簡單、分析級的LC方法將緩激肽與相似度很高的內源性干擾物分離開來，LC總運行時間僅為 3.5分鐘。與傳統的C18全多孔色譜柱相比，CORTECS UPLC C18 實心核顆粒色譜柱改善了峰形，提高了緩激肽檢測的靈敏度。CORTECS UPLC C18色譜柱、混合型弱陽離子交換SPE以及 m/z較高的b或y MS碎片離子的聯合使用提供了理想的選擇性和靈敏度水平，從而實現了準確定量并從200 μL血漿中區分緩激肽濃度細微差異。標準曲線在5-10000 pg/mL的范圍內準確精密。在高于基底濃度的情況下可精確定量的緩激肽低濃度為5 pg/mL。所有濃度的QC樣品均符合FDA法規標準4,5 ，平均準確度范圍為99.8-106.8，平均CV%為0.5- 5.5。以上數據證實了這是一種準確且可重現的方法。本研究還證實了采用合適的蛋白酶抑制劑樣品收集方式對于準確測定緩激肽內源性濃度的重要性。此外，如果需要執行進一步驗證，本方法在通過LC-MS/MS對PK和臨床研究的患者樣品進行高靈敏度的緩激肽定量方面也表現出巨大的潛力。