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技術文章

分析丙烯酰胺的實驗方法

閱讀:1076          發(fā)布時間:2020-5-25

化學試劑:丙烯酰胺Acrylamide,C3H5NO,CAS: 79-06-1  建議的內(nèi)標:D3-丙烯酰胺

色譜流動相的制備:流動相A:在1 L HPLC級的水中,加入10 µL甲酸。 流動相B:在1 L HPLC級的甲醇中,加入10 µL甲酸。

樣品制備試劑 :Carrez ReagentⅠ  K4Fe(CN)6 • 3H2O。 Carrez ReagentⅡ (七水合硫酸鋅) ZnSO4 • 7H2O。

洗脫液的制備: Carrez 試劑Ⅰ:溶解37.5 g K4Fe(CN)6•3H2O于250 mL HPLC級的水中。 Carrez 試劑Ⅱ:溶解 75 g ZnSO4 • 7H2O于250 mL HPLC級的水中。

 

樣品制備 :基于Buhlert和Hartig等人提出的方法[1,2]: 1. 稱量5 mL勻漿的樣品; 2. 加入50 mL環(huán)己烷 / 丁基甲基醚 ( 95 / 5 ) 混合溶液進行脫脂; 3. 空氣干燥; 4. 加入500 µL內(nèi)標D3-丙稀酰胺溶液 ( 10 µg/mL, 溶解于 HPLC級的水中),得到內(nèi)標濃度約為10 ng/mL的溶液; 5. 加入95 mL HPLC級的水,40 ℃超聲提取10 min (溶液中加入剪成碎片的過濾紙); 6. 加入2.5 mL Carrez 試劑Ⅰ和2.5 mL Carrez 試劑Ⅱ,進行蛋白質沉淀; 7. 過濾并離心; 8. 如果需要沉淀*,將溶液冷卻至 -18 ℃,然后迅速暖至室溫,離心; 9. 用水稀釋上清液(稀釋比例1 / 4 , V/V)。

 

基于Tareke等人提出的方法[3]: 1. 稱量10 g勻漿的樣品; 2. 加入100 mL水,和100 µL內(nèi)標 D3-丙稀酰胺 (10 µg/mL,溶解于HPLC級的水中); 3. 于12 mL Pyrex 玻璃離心管中進行離心; 4. 14000 r/min離心10 min,上清液移入兩支Eppendorf管中; 5. 用乙腈活化固相提取柱,然后用水清洗(2×2 mL) (多模式分離,300 mg,International Sorbent Technology 有限公司); 6. 棄去開始的1 mL濾液; 7. 其他的洗脫液,用0.45 µm 濾膜進行過濾; 8. 用 500 µL超濾器 (Microcon YM-3, Millipore),14000 r/min 離心10 min進行超濾,接收200 µL濾液。

 

 

基于Jürgen Buhlert (CVUA Sigmaringen, 德國) 提出的方法(牛奶基質): 1. 用5倍的水稀釋樣品 (V/V); 2. 加入內(nèi)標D3-丙稀酰胺 ; 3. 用Carrez試劑Ⅰ和Ⅱ進行蛋白質沉淀; 4. 過濾; 5. 在LC-MS/MS進樣前,每1 mL上清液中加入4 µL 甲酸。

 

 

色譜分離條件 Agilent 1100 系統(tǒng):G1312A二元泵系統(tǒng)、G1367A型自動進樣器、柱溫箱。 色譜柱[2]:1. Phenomenex Luna,3 µm,C18,150 mm×3 mm,基質較簡單時推薦使用; 2. Thermo Electron Hypercarb,5 µm,100 mm×3 mm,基質較簡單時推薦使用 (例如可可飲料,全麥面包等) 。 流動相:A相—水 + 0.1% 甲酸;B相—甲醇 + 0.1%甲酸。 

 

MS/MS 檢測 API 3200™或3200 QTRAP® LC-MS/MS液質分析系統(tǒng)。TurboIonSpray 離子源、正離子方式、MRM掃描 方式。 

 

 

 

 

 

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