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【專題】分子克隆實驗專題--(五)感受態細胞的選擇與使用

時間:2019-4-17閱讀:3931
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分子克隆實驗專題--(五)感受態細胞的選擇與使用
常用感受態細胞的特性:
*0,DH5α:藍白斑篩選,克隆,質粒抽提
JM110:甲基化酶缺陷型
SURE:克隆不穩定插入片段,降低同源重組
DH10B:文庫構建,長片段質粒的克隆(150kp
      質粒轉化)
Stbl2:克隆不穩定插入片段,正向重復,逆轉錄病毒序列,克隆甲基化基因組序列。
Stbl3:克隆慢病毒表達載體中的正向重復序列,降低逆轉錄病毒載體中長末端重復序列的非目標同源重組。

?        選擇適宜的感受態細胞
       序列的結構,長度,載體種類以及特殊要求等。
?        選擇適宜的轉化方式
       熱激轉化:常規克隆,片段較短(<10kb)
       電轉化: 建庫,基因敲除,長片段(>10kb)

感受態細胞使用的注意事項

?        連接產物或質粒的量
      效價:1μg標準質粒轉化感受態細胞產生的單克隆的數目,單位為cfu。
      化學感受態細胞:106,107,108,109cfu
      電轉感受態細胞:108,109,1010cfu
      常規的克隆根據連接產物和質粒的量選擇適當效價的感受態細胞,特殊轉化(如建庫)則選擇感受態細胞,一般選用電轉。

?        感受態細胞效價測定
      標準質粒:pUC18, pUC19,pBR322
                        超螺旋,超純
      質粒使用量:<5μl, <1ng
      設立陰性對照,多涂幾板(3塊以上)取平均值。
?        化學感受態細胞的使用
       質粒PCR擴環的產物以及進行體內重組的線性片段不宜選用DH5α感受態細胞進行轉化。
       可能原因: DH5α本身不適合這種操作;感受態制備的試劑對于這種轉化有抑制作用。
        可選用*0感受態細胞。
?        電轉感受態細胞的使用
      盡量降低轉化產物的離子濃度,防止細胞被擊穿。
      大量的連接產物提純后進行轉化,或者進行透析后再轉化,有些進行體內重組的酶切產物進行提純后進行轉化。
?        氨芐平板的衛星菌落
       氨芐平板涂板后如果時間太長,就會產生衛星菌落,在單克隆周圍生成小的克隆。
       氨芐抗生素只能抑制菌落生長,而不能殺死,當抗生素降解失效后,被抑制的菌體重新形成菌斑。
        解決方法:使用新鮮配置的氨芐培養基平板,提高氨芐的使用量,選用高質量的氨芐抗生素。

?        感受態細胞的取用
       特殊制備的感受態細胞在超低溫條件下可以維持效價半年以上,在制成之后要立即放入超低溫冰箱。
       感受態細胞對溫度的變化非常敏感,取用時要快取快放,不能將整包的細胞放在外面然后取用。
       看清標記,防止拿錯。

 

上海淳麥生物科技有限公司  感受態細胞專家  4006815880

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