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上海淳麥生物科技有限公司

*0感受態細胞 說明書

時間:2019-10-7閱讀:1852
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*0 Electro
*0 Electroporation-Competent Cell
產品規格:

* Electroporation-Competent Cel50μl×5
pUC19 (control vector, 10pg/μl)10μl

*0 電轉化感受態細胞基因型:

F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80 lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araΔ139Δ(ara-leu)7697 galU  galK

rpsL (Strr)endA1 nupG

*0 電轉化感受態簡要說明:

*0 電擊感受態細胞只能用于電擊轉化,不能用于熱激轉化。-CMbio-

*0 來源于 MC1061 菌株,是目前實驗室常用的感受態細胞之一,基因型與 DH10B 高度類似 (DH10B 為 galE15 型,而 *0 為 galU 型)。*0 生長速度快 (比 DH5α快,但比 Mach1-T1 生長速度慢),10 小時可見克隆。recA1 和 endA1 的突變有利于插入 DNA 的穩定和高純度質粒 DNA 的提取。可用于構建克隆,藍白斑篩選等實驗,具有鏈 霉素抗性。-CMbio-

  1. -CMbio-*0 電擊感受態細胞經特殊工藝制作,pUC19 質粒檢測轉化效率可達 1×1010 cfu/μg DNA


*0 電轉化感受態操作說明:

1. 0.1 cm 電擊杯和杯蓋從儲存液中拿出倒置于干凈的吸水紙上 5 分鐘,待其瀝干水分,正置 5 分鐘,使乙 醇充分揮

發,待乙醇揮發干凈立即插入冰中,壓實冰面,電極杯頂離冰面 0.5 cm 以方便蓋上杯蓋,冰中 靜置 5 分鐘充分降溫。

2. 取-80℃保存的 *0 電擊感受態細胞插入冰中 5 分鐘,待其融化,加入目的 DNA (質粒或連接產物) 并用手 EP 管底輕輕混勻,避免產生氣泡,立即插入冰中。-CMbio-
A. 測定轉化效率使用 1 μl 10 pg/μl 的對照質粒  pUC19;-CMbio-

B. 對于連接產物,請用乙醇沉淀 DNA 后加入適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重 懸,DNA 濃 度不超過 100 ng/μl,體積不超過 5 μl/50 μl 感受態。-CMbio-
3. 用 200 μl 槍頭(用刀切除 0.5cm 槍尖)將感受態-DNA 混合物快速移到電擊杯中,避免產生氣泡,蓋上杯蓋。

4. 啟動電轉儀,設置參數:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此為 BioRad 電轉儀推薦參數,也可按所用 電轉儀 推薦的參數操作),將電擊杯快速放入電轉槽中,電擊完成快速插入冰中。-CMbio-
5. 2 分鐘后從冰中取出電擊杯,放室溫,加入 1ml 不含抗生素的無菌 S.O.C. 培養基(室溫),用 1ml 槍吹吸電擊杯 底部數次混勻后,轉移到 50 ml 離心管(BD Falcon 50 ml 錐形離心管等),向離心管中 補加 S.O.C. 培養基至 10 ml。 傾斜 45 度放入搖床,37℃,225 rpm 復蘇 60 分鐘。-CMbio-
6. 5000 rpm 離心一分鐘收菌,重懸后取 100-200 μl 涂布到含相應抗生素的 S.O.C 平板上(因菌量較大, 若全部涂 板請選用直徑 15cm 培養皿 2-5 個)。將平板倒置放于 37℃培養箱過夜培養 13-17 小時。-CMbio

*0 電轉化感受態注意事項:
1.  加入 DNA 時體積不應大于感受態體積的 1/10。 -CMbio-

2. 電擊感受態細胞加入電擊杯應避免產生氣泡,氣泡會增加弧光放電風險。-CMbio-

3. 當 DNA 不純或存在鹽,乙醇,蛋白及緩沖液等污染時,轉化效率急劇下降。-CMbio-

4. 電擊杯里的離子可增加溶液的電導,增大在含有細胞和 DNA 的溶液中產生電流和弧光放電的風險。

5. 若轉化大質粒或想獲得較高轉化效率,推薦使用高純質粒提取試劑盒提取質粒。質粒增大一倍,轉化效率下降一個 數量級。-CMbio-
6. 對于連接產物轉化,轉化前乙醇沉淀 DNA 后用適量 TE 緩沖液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重懸產 物,保證 DNA 濃度不超過 100 ng/μl。過高濃度連接產物或過大體積連接產物會降低轉化效率,增加弧光放電的風險。 7. 混入質粒時應輕柔操作,吸取感受態細胞時避免用力過猛,以免剪切力過大損傷細胞膜,降低轉化效率。轉化高濃


度的質粒或連接產物可相應減少終用于涂板的菌量。-CMbio-

8. 電擊感受態細胞保存在-80℃以下,高于-80℃超期儲存會導致轉化效率會下降。-CMbio-

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