由于三維超景深顯微鏡的工作距離十分的小，所以大家在使用油鏡的時候一定小心，以防在操作中損壞物鏡上的透鏡以及樣本玻片。
使用的過程通常都是遵循從低倍鏡開始、再到高倍鏡，到油鏡的過程進行操作的。如果本身就是使用的高倍鏡，那么就沒有必要再轉換成低倍鏡重新開始了，只需直接轉換成油鏡即可。
如果所使用的顯微鏡本身是帶有止降功能的，那么在使用時，將香柏油滴加一滴至所觀察的載玻片上，將油鏡下移至油滴中，直到停止下降為止，之后再使用微調進行細微的調節直至清晰的物像；而如果所使用的顯微鏡是沒有自動止降功能，那么載玻片上滴加過香柏油之后，下移物鏡時就應該從側面進行觀看，將物鏡下移至稍微與載玻片接觸，之后再進行向上微調，直至調準焦點。
三維超景深顯微鏡的工作原理：
1.折射和折射率：
光線在均勻的各向同性介質中，兩點之間以直線傳播，當通過不同密度介質的透明物體時，則發生折射現象，這是由于光在不同介質的傳播速度不同造成的。當與透明物面不垂直的光線由空氣射入透明物體(如玻璃)時，光線在其介面改變了方向，并和法線構成折射角。
2.透鏡的性能：
透鏡是組成三維超景深顯微鏡光學系統的基本的光學元件，物鏡目鏡及聚光鏡等部件均由單個和多個透鏡組成。依其外形的不同，可分為凸透鏡(正透鏡)和凹透鏡(負透鏡)兩大類。
當一束平行于光軸的光線通過凸透鏡后相交于一點，這個點稱"焦點"，通過交點并垂直光軸的平面，稱"焦平面"。焦點有兩個，在物方空間的焦點，稱"物方焦點"，該處的焦平面，稱"物方焦平面"；反之，在象方空間的焦點，稱"象方焦點"，該處的焦平面，稱"象方焦平面"。
光線通過凹透鏡后，成正立虛像，而凸透鏡則成正立實像。實像可在屏幕上顯現出來，而虛像不能。
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