T7高收率RNA合成試劑盒優化轉錄反應體系，利用T7 RNA聚合酶，以T7啟動子序列為模板的線性雙鏈DNA，以NTPs為底物控制啟動子下游DNA序列，高效合成單鏈RNA。在轉錄過程中，修飾過的核苷酸可以加入底物中制備生物素或染料標記RNA。T7 Co-transcription RNA Synthesis Kit 進行了轉錄反應體系的優化，試劑盒使用T7 RNA聚合酶并以含有T7啟動子序列的線型雙鏈DNA為模板，以NTPs為底物，對啟動子下游的DNA序列進行轉錄，高效合成單鏈RNA。轉錄時可在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標記的RNA。

產品信息：

產品組分：

T7 RNA Polymerase Mix、10xTranscription Buffer、ATP/CTP/GTP/N1-Me-PUTP、CAP GAG、質粒DNA模板

試劑盒中帽類似物可進行選擇，惠誠生物可提供帽類似物:CAP GAG、CAP GAG (3'OMe)、CAP GAU、CAP GAG(m6A)以及新型帽類似物CAP4、CAP5、CAP7、CAP8、CAP 等

以下成分以EasyCаp™ GAG  m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 100mM Ammonium solution, GMP grade 貨號:CAP3011為例：

常見問題解答：

1. 轉錄產量低

模板的質量與成品率密切相關。試驗組的產量顯著低于對照組，可能的原因有:①實驗模板含有抑制成分;模板有問題。

建議:①重新純化模板;②確定模板定量及其完整性;③延長反應時間;④增加模板輸入量;⑤嘗試其他啟動子和RNA聚合酶。

2. 短轉錄產量低

短轉錄起始片段會抑制該反應。當轉錄產物小于100 nt時，延長反應時間至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA產量。

3.RNA轉錄長度大于預期

如果電泳顯示產物條帶大于預期條帶，可能的原因是:①質粒模板可能沒有完(空)全線性化;②感覺鏈3’端結構突出;③RNA具有未完(空)全變性的二級結構。

建議:①檢查模板是否完(空)全線性化，必要時進行額外線性化;②選擇合適的限制性內切酶，避免3'外翻，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成轉錄后再繼續;③用變性凝膠檢測RNA產物。

4. RNA轉錄長度低于預期

如果電泳顯示產物條帶小于預期大小，可能的原因是:①模板中含有類似于T7 RNA聚合酶的終止序列;②模板中GC含量較高。

建議:①降低反應溫度(如30℃)。有時降低溫度可以增加轉錄長度，但會降低產量。或者嘗試不同的RNA聚合酶進行轉錄;②若模板GC含量較高，可采用42℃轉錄，或添加SSB以增加產量和轉錄長度。

5. 轉錄產物的電泳跟蹤

電泳過程中出現拖尾現象。可能原因:①實驗操作過程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板。

建議:①使用不含RNase的移液針尖和EP管，佩戴一次性乳膠手套和口罩，所有試劑均使用不含RNase的H2O制備。②重新純化模板DNA。

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