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常見蛋白質印跡問題的提示和技巧

閱讀:899      發布時間:2024-1-3
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蛋白質印跡是研究實驗室普遍使用的一種技術,用于研究感興趣的蛋白質。蛋白質印跡用于抗體驗證、蛋白質-蛋白質相互作用研究以及許多其他應用。1然而,生成可解釋的蛋白質印跡結果可能具有挑戰性。以下是一些常見問題以及解決方法。

高背景

可能是由于嘗試這個
高抗體濃度使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質對照。
封閉液使用新鮮的封閉液,增加封閉時間/溫度,嘗試不同的封閉劑。
印跡在封閉/洗滌過程中干燥確保膜在封閉和清洗步驟中被充分覆蓋。
洗得不夠增加洗滌次數和洗滌液體積。確保至少洗滌 3 次,每次 5 分鐘。
膠片曝光過度嘗試較短的曝光時間。















沒信號

可能是由于嘗試這個
抗體濃度太低使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質對照。
樣品中目標含量低增加凝膠上的蛋白質濃度。建議滴定。
一抗和二抗不匹配確保二抗針對一抗的宿主物種。
轉移問題使用帶有顏色的蛋白質標記來檢查轉移。使用對照蛋白優化轉移。轉移前檢查是否有氣泡。
洗次數太多減少洗滌次數。















多頻段

可能是由于嘗試這個
凝膠超載滴定加載在凝膠上的蛋白質樣品。
使用過多抗體使用一抗和二抗進行滴定。包括已知的蛋白質對照。
膠片曝光過度嘗試較短的曝光時間。
阻塞問題使用新鮮的封閉液,增加封閉時間/溫度,嘗試不同的封閉劑。
目標蛋白的翻譯后修飾研究發表了目標蛋白翻譯后修飾的例子,可以提供生物學解釋(即磷酸化、糖基化、核糖基化)。
翻譯后裂解許多蛋白質被合成為前蛋白質,然后被切割成活性形式,例如前半胱天冬酶。研究針對您的目標發布的示例。
拼接變體選擇性剪接可能會產生由同一基因產生的不同大小的蛋白質。研究針對您的目標發布的示例。


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