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技術(shù)原理
       慢病毒包裝：使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，過表達(dá)慢病毒系統(tǒng)使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三質(zhì)粒系統(tǒng)，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，培養(yǎng)48h后，收集上清。純化后留取部分檢測病毒滴度，其余病毒凍存于-80℃冰箱中。
       滴度檢測：將病毒顆粒使用梯度稀釋，分別感染293T細(xì)胞，感染72h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞熒光量計(jì)算病毒滴度。
       細(xì)胞感染：在病毒感染前一天對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種約10000個(gè)細(xì)胞于12孔板中，培養(yǎng)過夜后使用無血清培養(yǎng)基稀釋病毒，加入12孔板中對細(xì)胞進(jìn)行感染，病毒數(shù)量根據(jù)推薦細(xì)胞的感染MOI加入（若無推薦MOI，需做病毒梯度：1,5,10,50,1005個(gè)梯度對細(xì)胞感染），感染6h后去除含病毒溶液，加入wam全培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光強(qiáng)度。同時(shí)加入puromycin對細(xì)胞篩選，篩選約2周時(shí)間。細(xì)胞篩選好后，使用定量PCR和Westernblot檢測目的基因的穩(wěn)定表達(dá)情況。
實(shí)驗(yàn)方法

技術(shù)總結(jié)：
       1、MOI（multiplicityofinfectin），感染復(fù)數(shù)，含義為感染時(shí)病毒和細(xì)胞數(shù)量的比值。多數(shù)細(xì)胞查閱文獻(xiàn)也能獲得推薦的MOI，但不同實(shí)驗(yàn)室，不同病毒測算出的MOI也有差別。所以建議根據(jù)自己包裝的慢病毒重新檢測MOI。
       2、為了能獲得最佳效果的單克隆穩(wěn)定細(xì)胞株，可以增大篩選的總量。