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細胞凋亡檢測科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：104 發(fā)布時間：2024-9-19
應(yīng)用簡介
細胞凋亡是細胞主動實施的一種程序性死亡，是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。
技術(shù)原理
AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS高親和力特異性結(jié)合。因此AnnexinV作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將AnnexinⅤ進行熒光素FITC標記，以標記了的AnnexinV作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。碘化丙錠（PropidiumIodide,PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜使細胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區(qū)分開來。
基本特征：
細胞凋亡具有特定形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征：
1、形態(tài)學(xué)特征：凋亡常發(fā)生于單個細胞，其形態(tài)變化分3個階段：第一階段可見凋亡細胞與相鄰細胞分離，細胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，聚集于核膜周圍呈半月形，亦可發(fā)生核斷裂，核仁裂解。第二階段可見細胞表面突出，分成多個膜包繞小體，含有部分核和／或完整的細胞器，稱為凋亡小體（apoptosisbodies）。第三階段，凋亡小體被組織細胞或吞噬細胞吞噬降解。在有內(nèi)皮的腔中如膽管、凋亡小體可以排入腔內(nèi)；在組織培養(yǎng)中，凋亡細胞與鄰近細胞和培養(yǎng)基質(zhì)相分離。整個凋亡過程在幾小時內(nèi)全部完成。與壞死相比，凋亡的顯著特點是整個過程中漿膜保持完整，減少了細胞成分外漏，因此，沒有或僅有很輕炎癥反應(yīng)。而壞死是病理因素作用使細胞膜失去完整性而引起細胞溶解，通常波及相鄰細胞，表現(xiàn)為細胞腫脹，細胞器溶解，細胞膜破裂，伴有組織炎癥。由于凋亡過程迅速，凋亡小體較小，因此，在光鏡下不易發(fā)現(xiàn)細胞凋亡。
2、生物化學(xué)特征：細胞凋亡的生物化學(xué)特征是DNA斷裂，這種斷裂不是隨機的，它與細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶的激活有關(guān)。在內(nèi)切酶作用下，細胞核中的DNA裂解成核小體大小的片段，每個核苷酸片段大約有180～200個堿基對。在瓊脂糖凝膠電泳上出現(xiàn)典型的階梯樣的DNA區(qū)帶。而壞死的細胞，DNA被溶酶體釋放的多種水解酶隨機降解，DNA電泳呈模糊、微弱的蹤跡，不能形成階梯狀，以此可區(qū)別細胞凋亡和壞死。但是核小體斷裂是凋亡的晚期表現(xiàn)，并不普遍存在。
實驗方法
1、誘導(dǎo)培養(yǎng)細胞時間要準確。
2、AnnexinV是光敏物質(zhì)，在操作時要注意避光。
3、細胞凋亡是一個動態(tài)的過程，反應(yīng)一小時后熒光強度就開始衰變，熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。
4、整個操作過程動作要盡量輕柔，切勿用力吹打細胞，盡量在4℃下操作。