高效qinliugan病毒小鼠感染模型的構建流程

（一）背景

近日，全球病毒網絡 (GVN) 是一個由linxian的人類和動物病毒學家組成的國際聯盟，其遍布 40 多個國家的 80 多個zhuoyue中心和附屬機構已在《柳葉刀區域衛生 - 美洲》上發表了關于北美正在發生的 H5N1 qinliugan疫情的詳細分析和緊急行動呼吁。頂尖科學家發表了一項行動呼吁，敦促全球各國政府應對北美日益嚴重的 H5N1 qinliugan疫情，該疫情已感染動物和人類，并造成了重大農業損失。

（二）qinliugan病毒（H5N1/H7N9）小鼠感染模型構建標準操作流程

主要儀器設備：北京元森凱德生物公司研制生產的動物全身/口鼻動態氣溶膠暴露系統） + YSKD動物氣管肺遞送定向暴露模塊  

生物安全等級：BSL實驗室（符合WHO《實驗室生物安全手冊》第四版） 

一、實驗前準備

1. 動物選擇與預處理

6-8周齡SPF級BALB/c或C57BL/6小鼠（優先選擇IFNAR1敲除品系以增強病毒易感性），獨立通風籠具（IVC）中預適應7天，溫度22±1℃，濕度50-60%，12小時光照循環，通過實驗動物福利倫理委員會審批（參考AAALAC國際認證標準） 

2. 病毒株與攻毒液配制

病毒株H5N1或H7N9，TCID??測定為1×10?~1×10?/mL，病毒原液以PBS（含0.3% BSA、100 U/mL青霉素/鏈霉素）稀釋至目標濃度，分裝后-80℃保存，使用前經三次凍融循環確保病毒顆粒分散 

二、 病毒接種及感染模型構建步驟

2.1病毒稀釋：將H5N1qinliugan病毒株用病毒培養基稀釋成不同濃度，低劑量感染組為1×10^4 PFU/mL，高劑量感染組為1×10^6 PFU/mL。

2.2 動物全身動態吸入/口鼻暴露染毒(北京元森凱德生物技術公司研制生產)

粒徑控制：1-3 μm（模擬呼吸道飛沫核心粒徑） 

暴露時間：全身暴露模式：30分鐘（總病毒載量1×10?~1×10? PFU/只），口鼻暴露模式：15分鐘（靶向劑量1×103~1×10? PFU/只）

2.3動物氣管肺遞送精準定向暴露

小鼠麻醉：將小鼠放入麻醉誘導箱，使用3%異氟醚誘導麻醉，待小鼠倒立無掙扎后，轉入維持濃度為1.5% - 2%的麻醉狀態。

氣管內定量霧化接種：

將麻醉后的小鼠固定在BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD生物安全型小動物固定操作臺上，頭部向上，頸部稍后仰。使用北京元森凱德生物技術有限公司研制生產的微量氣管內液體霧化器【可精準定量】吸取適量的病毒稀釋液（低劑量組50μL/只，高劑量組100μL/只），經BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD小動物可視化插管喉鏡（內置微型CMOS攝像頭，支持實時圖像傳輸至外接顯示屏），緩慢插入到小鼠的氣管處，使病毒液霧化噴霧流入氣管。對照組滴加等體積的病毒培養基。

2.4 感染后處理

小鼠轉移至生物安全隔離籠具，恢復自主呼吸，實時監測生命體征（呼吸頻率、活動度），記錄感染后0小時基線數據。 

三、感染進程監測

3.1. 臨床觀察與樣本采集

感染后第1、3、5、7天，監測指標/臨床癥狀：體重下降率（>20%為人道終點）、豎毛、呼吸困難評分（0-4級） 

樣本采集： 

    - 鼻咽拭子（病毒脫落量檢測） 

    - 肺泡灌洗液（BALF，qRT-PCR檢測病毒載量） 

    - 肺組織病理切片（HE染色評估間質性肺炎程度） 

3.2. 病毒動力學分析

qRT-PCR引物設計：靶向HA基因保守區（如H5N1 HA-F:5'-CAGCAATGCAGRACAGAT-3'），病毒滴度測定：MDCK細胞培養法（TCID??/mL） 

3.3. 免疫應答檢測

血清抗體：感染后第14天采集血清，ELISA檢測H5N1特異性IgG（OD450≥0.5為陽性），細胞免疫：流式細胞術分析肺組織CD8? T細胞比例（CD44?CD62L?效應表型） 

四、模型驗證標準

4.1 感染成功率：感染后72小時肺組織病毒載量≥1×10? TCID??/g 

4.2 病理特征：典型肺泡上皮細胞壞死+淋巴細胞浸潤（病理評分≥3分） 

4.3一致性驗證：同一批次實驗組內個體差異≤15%（CV值） 

五．注意事項

5.1. 實驗人員需全程佩戴正壓防護服（PAPR）及雙重手套 

5.2. 病毒滅活：所有接觸材料需經121℃高壓滅菌30分鐘 

5.3. 動物倫理：體重下降超過25%或出現嚴重呼吸困難時立即實施安樂處死(北京元森凱德（YSKD）提供自動型實驗動物安樂窒息系統) 

本方案結合北京元森凱德生物技術有限公司,簡稱元森凱德（YSKD）研制生產的高精度氣溶膠全身/口鼻動態氣溶膠暴露系統） +動物氣管肺遞送定向暴露模塊與閉環生物安全設計，確保實驗可重復性。可滿足qinliugan病毒跨宿主傳播機制研究、疫苗效力評價等前沿科研需求。

附：北京元森凱德生物技術有限公司研制生產的動物霧化吸入給藥儀器，主要包括大/小動物肺部氣管直接遞送裝置（動物氣道霧化針）、動物口鼻吸入、僅鼻腔給藥、全身式暴露染毒、動物煙氣/PM2.5染毒系統、粉塵氣溶膠發生器、臭氧動物暴露裝置、動物高低壓氧艙，此外給客戶多樣化提供自動型實驗動物anlesi系統（窒息系統、二氧化碳安樂處死箱），實驗動物除臭暫存系統，巴馬香豬皮，NGI Gentle Rocker智能洗盤裝置，NGI新一代撞擊器和ACI安德森撞擊器的校驗與檢測。

附：北京元森凱德生物技術有限公司（BEIJING YSKD BIO-TECHNOLOGY CO.,LTD），簡稱元森凱德（YSKD），2013年成立于北京中關村科技園，是一家專業從事生命科學類實驗儀器研制、生產與銷售的科技創新型企業。服務毒理學、藥理學、免疫學、生物安全、大氣污染物、化學物質毒性鑒定、臨床前藥物開發與安全性評價、呼吸系統、環境與健康等領域。

部分用戶案例：哈佛大學，麻省理工學院，新加坡國立大學，瑞士蘇黎世聯邦理工學院，中國科學院上海藥物研究所，中國中醫科學院中藥研究所，麗珠醫藥集團股份有限公司，康龍化成（寧波）生物醫藥有限公司，中日醫院呼吸病學研究中心/中日友好臨床醫學研究所，北京中醫藥大學，中國藥科大學，沈陽藥科大學，復旦大學，浙江大學，四川大學，中南大學湘雅醫學院等