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CHIP染色質免疫沉淀實驗過程中的建議
閱讀：977 發布時間：2022-2-14染色質免疫沉淀 (ChIP) 是一種用于表觀遺傳學研究的技術，可以快速反映蛋白質-DNA 相互作用。 想要獲得理想的結果，選擇適合的抗體固然很關鍵，ChIP 流程中所有步驟也很重要。 該技術利用了多種分子生物學和蛋白質組學方法。
CHIP免疫沉淀實驗原理：
染色質免疫沉淀技術的原理是：在生理狀態下把細胞內的DNA與蛋白質交聯在一起，通過超聲或酶處理將染色質切為小片段后，利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA的片段沉淀下來。染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。因為ChIP實驗涉及的步驟多，結果的重復性較低，所以對ChIP實驗過程的每一步都應設計相應的對照，而且對結果的分析也需要有一定的經驗。對于剛剛開始使用ChIP技術的研究人員來說，使用成熟的商品化試劑盒和相關的技術服務會達到事半功倍的效果。
CHIP免疫沉淀實驗步驟
細胞固定
甲醛能有效的使蛋白質-蛋白質，蛋白質-DNA，蛋白質-RNA交聯，形成生物復合體，防止細胞內組分的重新分布。甲醛的交聯反應是*可逆的，便于在后續步驟中對DNA和蛋白質進行分析。交聯所用的甲醛終濃度為1%，交聯時間通常為5分鐘到1個小時，具體時間根據實驗而定。值得注意的是，交聯時間如果過長，細胞染色質難以用超聲波破碎，影響ChIP結果，而且實驗材料也容易在離心過程中丟失。交聯時間如果過短，則交聯不*，產生假陰性。甲醛的交聯反應可被加入的甘氨酸終止。
染色質斷裂
交聯后的染色質可被超聲波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用瓊脂糖凝膠電泳檢測），以便暴露目標蛋白，利于抗體識別。超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，這都會引起蛋白質變性，進而影響ChIP的效率。所以在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續的超聲程序，保證低溫。另外，超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。總超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。
通過五個步驟獲得理想 ChIP 結果
CHIP免疫沉淀建議
使用的交聯劑類型取決于需要觀察的相互作用的類型
交聯不充分，以及與甲醛過度交聯，會增加背景信號并導致 DNA 丟失
過度交聯會影響抗原的結合，掩蓋表位，妨礙超聲處理
在顯微鏡下比較樣品前后變化，檢查細胞裂解的效率
不同類型的細胞有不同嚴格程度的裂解要求
如果在裂解中使用超聲處理，應將染色質置于在冰上并將脈沖限制在 30 秒以內，以避免蛋白質因過熱而變性。