非蛋白巰基測定試劑盒說明書
微量法100T/48S
注 意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
生物體內巰基主要包括非蛋白質巰基和蛋白質巰基。巰基化合物在體內具有重要的解毒功能，對生物體的自我調節具有非常重要的生理意義。
測定原理：
巰基基團與5,5’-二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。
自備實驗用品：
天平、研缽、恒溫水浴鍋、酶標儀、96孔板、乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體18 mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體1mL×1管，4℃避光保存。
樣品的制備：
1. 按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 血清，培養液：取0.1mL樣本，加入0.4mL提取液，混勻，室溫靜置10min, 然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
操作步驟：
1、 酶標儀預熱30min，調節波長至412nm。
2、 操作表
在96孔板中加入如下試劑
對照管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 40 | 40 |
試劑一（μL） | 150 | 150 |
試劑二（μL） | 10 | |
乙醇（μL） | 10 | |
混勻，25℃靜置10min，測定412nm吸光值。ΔA=A測定-A對照。每個測定管設一個對照管。 | ||
計算公式：
非蛋白巰基標準曲線：y = 1.8111x - 0.0037，R2 = 1，x為標品濃度，單位μmol/mL，y為吸光度ΔA。
1. 組織：
（1）按樣本重量計算
非蛋白巰基含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷W
=0.552×（ΔA+0.0037）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
非蛋白巰基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×V樣總÷Cpr
=0.552×（ΔA+0.0037）÷Cpr
2. 血清、培養液：
非蛋白巰基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷1.8111×5×103
=2761×（ΔA+0.0037）
V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5：血清，培養液等液體樣本稀釋倍數；103 ：1mmol/ L=103μmol/ L
注意事項：
Z低檢出限為10μmol/L。
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